兔聲帶成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)、示蹤與聲帶瘢痕的研究.pdf

1、正常聲帶組織因外傷或疾病損傷后所形成的纖維組織替代產(chǎn)物形成了聲帶瘢痕。由于瘢痕組織使聲帶變得堅(jiān)硬，影響了聲帶固有層的粘彈性（viscoelastic strength），改變了聲帶的生物力學(xué)特性，從而減弱聲帶振動(dòng)黏膜波的產(chǎn)生而影響發(fā)聲。目前，尚未找到一種理想的預(yù)防和治療聲帶瘢痕的方法。近年來，組織工程學(xué)技術(shù)在組織器官重建方面取得了令人矚目的進(jìn)展，其主要原理是以少量種子細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后與生物材料、細(xì)胞因子結(jié)合，修復(fù)較大的組織或器官缺損，重

2、建組織器官的生理功能，最終達(dá)到完美的形態(tài)甚至功能修復(fù)的目的。將組織工程學(xué)的技術(shù)方法應(yīng)用于喉科，有望在未來實(shí)現(xiàn)聲帶，甚至喉的再生。人類的聲帶組織是一個(gè)高度分化的分層結(jié)構(gòu)，從組織學(xué)結(jié)構(gòu)上可分上皮層、固有層和肌肉層（甲杓肌）。聲帶固有層又分為固有淺層（Reinke’s層），固有中層和固有深層。這種分層在描述聲帶結(jié)構(gòu)功能方面具有重要意義。固有層是聲帶最重要的特征性結(jié)構(gòu)，主要包括細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分。組成固有層的細(xì)胞為數(shù)較少，主要細(xì)胞有：成纖維細(xì)

3、胞，肌成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。成纖維細(xì)胞是維持固有層結(jié)構(gòu)與功能的重要細(xì)胞，主要分布在固有層深層，其調(diào)控細(xì)胞間質(zhì)的沉著、降解及重新分布；細(xì)胞外基質(zhì)成分包括纖維蛋白和間隙蛋白。
　　 本研究第一部分我們首先制作了兔聲帶瘢痕模型，并對(duì)聲帶瘢痕進(jìn)行初步研究。在支撐喉鏡下，用喉鉗夾取雙側(cè)聲帶前中部組織（未達(dá)肌層），未手術(shù)者作為正常對(duì)照，1個(gè)月后處死動(dòng)物，收獲聲帶組織，采用Masson三色染色觀察聲帶膠原，采用經(jīng)過透明質(zhì)酸酶處理的Alcian

4、 blue染色觀察透明質(zhì)酸。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行對(duì)切片染色進(jìn)行半定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明瘢痕聲帶的膠原成分明顯增多，透明質(zhì)酸含量無明顯改變。
　　 本研究中，我們對(duì)聲帶固有層的組織工程學(xué)再生進(jìn)行了初步探索。組織工程學(xué)的三個(gè)要素是種子細(xì)胞，支架材料，和細(xì)胞因子。本研究第二二部分首先進(jìn)行了種子細(xì)胞-兔聲帶成纖維細(xì)胞（vocal fold fibroblasts，VFFs）的體外培養(yǎng)。取兔聲帶組織，消化法獲取

5、成纖維細(xì)胞，用含有胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，摸索出最佳培養(yǎng)條件。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，并經(jīng)過傳代使細(xì)胞純化。利用免疫組化方法，檢測(cè)成纖維細(xì)胞的特異性蛋白Vimentin，結(jié)果Vimentin陽性率90％以上，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，且陽性率較高。
　　 本研究第三部分觀察培養(yǎng)的細(xì)胞在異體生物體內(nèi)相容性及生長(zhǎng)情況。我們對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行Ad-EGFP標(biāo)記。取新西蘭兔6只，隨機(jī)選取2只兔作為無干

6、預(yù)組，4只新西蘭兔做雙側(cè)聲帶急性損傷模型，左側(cè)聲帶損傷部位注射104個(gè)/ml濃度的Ad-EGFP標(biāo)記的細(xì)胞混懸液，向右側(cè)聲帶損傷部位注入生理鹽水1ml作為對(duì)照。聲帶注射細(xì)胞后，兔生長(zhǎng)情況良好，均未發(fā)生感染、喉水腫，免疫排斥等反應(yīng)。15天后收獲聲帶組織，熒光顯微鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)成活的VFFs。說明單純VFFs注射到異體組織很難存活，為其在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)提供生長(zhǎng)支架可能會(huì)利于生長(zhǎng)。
　　 總之，本研究對(duì)聲帶組織工程學(xué)進(jìn)行了初步探索，制備