大連地區(qū)胃癌甲基化敏感標記物的判定.pdf

1、目的：胃癌（Gastric Cancer）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其致死率在世界范圍內位居所有惡性腫瘤的第二位，其中東亞、東歐及美洲中部和南部為胃癌高發(fā)區(qū)。胃癌在我國也是最常見、同時也是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。由于其發(fā)病隱匿，臨床癥狀在早期不明顯，病人一經發(fā)現(xiàn)多處于臨床晚期，目前對胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷缺少有效及敏感的方法，因而進一步了解胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其轉移特點對早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期預防胃癌都有重要的作用及意義。

2、 胃癌的發(fā)生是一個多基因、多因素、多階段及多途徑的復雜過程，涉及到遺傳學和表觀遺傳學方面的改變，已有研究證實，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，表觀遺傳學改變起到了非常重要的作用。表觀遺傳學改變是一種未涉及DNA序列變化的基因外調控機制，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、基因印記、染色體重塑和非編碼RNA調控等。其中DNA甲基化是目前人們研究最為深入的一種表觀遺傳學修飾方式，DNA的甲基化是指在DNA甲基轉移酶（DNMTs）的作用下，以S腺

3、苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體將甲基基團轉移到CG二核苷酸序列中胞嘧啶碳原子上的一種化學反應。CG二核苷酸富集的DNA片段稱為CpG島，哺乳動物的CpG島長約300-3000bp，CpG島常位于基因轉錄起始部位或起始部位附近，其中以脊椎動物的管家基因為代表。 大連地區(qū)具有自身特殊的地理地貌特點和這里的居民有長期形成的飲食習慣。流行病學研究發(fā)現(xiàn)大連居民大多喜食燒烤、腌制海鮮及泡菜等，而這類食物中含有大量的亞硝酸鹽類及多環(huán)芳烴類化

4、合物，其中許多是常見的致甲基化劑如亞硝酸鹽、笨并芘。經過長時間的刺激和積累，這些不佳的飲食習慣在很大程度上增加了本地區(qū)人群遺傳學及表觀遺傳學變異的幾率和罹患胃癌的風險。 在前期工作中發(fā)現(xiàn)了大連地區(qū)胃癌COX-2、S100A4、p16、hMLH1、E-cadherin等基因和位點啟動子區(qū)域存在異常的甲基化，導致相應基因表達下調或缺失。其中部分結果與以往的研究結果相同，部分結果也有不同之處如COX-2基因的甲基化在大連地區(qū)胃癌中呈現(xiàn)

5、增高趨勢，這一現(xiàn)象提示大連地區(qū)胃癌的高發(fā)機制可能與其他地區(qū)胃癌的發(fā)生機制不同，大連地區(qū)胃癌表觀遺傳學改變可能與本地區(qū)特殊的環(huán)境因素及人群遺傳背景相關。 基于去甲基化劑能使因高甲基化而沉默的基因恢復表達的這一原理，使用去甲基化劑消除人類腫瘤細胞基因組DNA的異常甲基化成為人們近年研究的熱點。去甲基化劑如5-azacytidine、5-aza-2’-deoxycytidine和zebularine已被廣泛應用于血液疾病臨床治療及多種

6、基礎研究中。基因啟動子區(qū)的高甲基化與基因沉默之間有著非常重要的聯(lián)系，去甲基化劑同樣也被應用于確認腫瘤細胞中沉默的基因是否由表觀遺傳學修飾所引起的。隨著人們對腫瘤表觀遺傳學認識的深入，去甲基化劑的研究和應用有著光明的應用前景，可能成為腫瘤治療的重要工具。 通過檢測特定區(qū)域腫瘤、癌前病變、癌旁相對正常及非癌正常對照胃粘膜組織的表觀遺傳學改變，判斷表觀遺傳學相關因素在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，探討大連地區(qū)胃癌高發(fā)的發(fā)病機制，為胃癌的臨

7、床早期診斷、預防及治療提供新的理論依據(jù)和指導。 方法：全部標本來自大連醫(yī)科大學遼寧?。ǜ咝＃┌┌Y基因組重點實驗室建立的人胃癌組織庫。在冰凍組織微陣列技術和定點捕獲技術基礎上，應用免疫組織化學法、免疫細胞化學法、RT-PCR、Westernblotting、細胞培養(yǎng)（加入去甲基化5-aza-dC）及甲基化特異性PCR（MSP）等方法，分別對不同病變胃組織及四個胃癌細胞系中10個敏感甲基化位點進行了分析；并對6個基因的表達及其與該基

8、因啟動子甲基化之間關系進行了探討；在以往的實驗基礎上還對本地區(qū)胃癌CIMP鑒定體系進行初步的摸索和創(chuàng)新。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS12．0軟件，應用Kruskal-Wallis和Mamm Whitney檢驗方法進行統(tǒng)計分析。 結果： 一、10個敏感位點在不同病變胃黏膜組織中的甲基化狀態(tài) 甲基化特異性PCR（MSP）結果顯示：在胃鏡、癌旁相對正常、癌前病變及胃癌組中，10個位點的甲基化頻率均呈現(xiàn)上升趨勢，除MINT2和T

9、HBS1基因外其余8個基因在正常胃組織中均有不同程度的甲基化，其中hMLH1、TIMP3、RASSF1A、MINT1、MINT2和E-cadherin基因在胃鏡組和胃病變組（癌旁相對正常、癌前病變、胃癌）間存在顯著統(tǒng)計學差異； hMLH1、TIMP3、RASSF1A、MINT2和E-cadherin基因在胃鏡組和癌旁相對正常組間存在顯著差別； p16、hMLH1、TIMP3、RASSF1A和MINT2基因在胃癌的發(fā)生過程中表現(xiàn)出持續(xù)的高

10、甲基化水平。 一、10個敏感位點在四個胃癌細胞系中的甲基化狀態(tài) 甲基化特異性PCR結果顯示：10個位點在四個胃癌細胞系（MGC803、BGC823、AGS和HGC-27）中的甲基化狀態(tài)為：AGS細胞系有兩個位點的甲基化（p16和TIMP3）；MGC803細胞系有三個位點的甲基化（TIMP3、RASSF1A和MINT1）；BGC823細胞系有四個位點的甲基化（TIMP3、RASSF1A、MINT1和MINT2）；HGC-2

11、7細胞系有5個位點的甲基化（p16、TIMP3、RASSF1A、MINT2和E-cad）。 三、甲基化高發(fā)位點在胃粘膜組織及四個胃癌細胞系中的表達情況 免疫組織/細胞化學結果顯示：p16、hMLH1、TIMP3、DKK3和E-cadherin五個基因在不同進展期胃病變中的表達與其甲基化結果基本呈負相關，證實了基因啟動子區(qū)異常高甲基化使相應基因表達下調或沉默。組織標本（G-102，腸上皮化生）和胃癌細胞系（MGC803、B

12、GC823和HGC-27）中有TIMP3基因甲基化和表達同時存在的情況，可能涉及到該基因部分甲基化或者部分細胞未甲基化及自動去甲基化等原因。 四、CIMP體系的建立 參照以往研究的結果和本實驗室之前對大連地區(qū)胃癌CIMP體系的初步探討加上本實驗對大連地區(qū)胃癌多基因甲基化與表達的研究，嘗試采用p16、hMLH1、TIMP3、RASSF1A和MINT2五個指標建立一個更適合本地區(qū)胃癌早期診斷和發(fā)現(xiàn)的CIMP鑒定體系。結果證實

13、此體系在胃癌發(fā)生的早期就表現(xiàn)出很高的靈敏性，有利于對易患個體進行胃癌的早期預警、早期預防和早期診斷。 五、去甲基化劑5-aza-dC在胃癌細胞系中的應用 用去甲基化劑處理MGC803和HGC-27細胞系，結果顯示使用去甲基化后，MGC803細胞系中RASSF1A基因在mRNA和蛋白水平恢復了表達，TIMP3基因在mRNA和蛋白水平的表達有所增強；HGC-27細胞系p16、RASSF1A、和E-cadherin基因恢復了m

14、RNA和蛋白水平的表達，TIMP3基因mRNA和蛋白的表達也有所增強。這些結果證實了DNA甲基化是抑癌基因或修復基因等的主要失活因素，因而在胃癌的發(fā)生發(fā)展中表觀遺傳學修飾起到了重要的作用。 結論： 一、表觀遺傳學改變尤其是DNA的甲基化是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件。大連地區(qū)胃癌呈現(xiàn)出多位點高甲基化特點，并且隨著病變的進展，基因的甲基化程度增強，甲基化位點也增加。與其他地區(qū)胃癌的研究結果相比，本地區(qū)人群在正常胃組織中有多

15、個基因（p16、hMLH1、TIMP3和RASSF1A等）的甲基化程度較高，這表明大連地區(qū)存在甲基化易患性，這些可能與本地區(qū)的飲食、環(huán)境等因素相關。 二、CIMP體系用于評估腫瘤基因組整體甲基化狀態(tài)，個體CIMP型的鑒定對臨床腫瘤發(fā)病風險的預測、預防及預后評價有重要作用。經研究發(fā)現(xiàn)，不同基因在不同地區(qū)胃癌中的甲基化狀態(tài)不同，因而對某個地區(qū)胃癌整體甲基化進行評估時應多采用一些甲基化敏感基因，從中選出適合本地區(qū)胃癌特點的檢測指標進而

16、建立自身的CIMP鑒定體系?；谶@樣的理念，選用p16、hMLH1、TIMP3、RASSF1A和MINT2五個指標建立了一個適合大連地區(qū)胃癌早期發(fā)現(xiàn)和診斷的CIMP體系。這五個指標在以往的研究中均被證實與胃癌關系密切，但將這五個位點作為綜合參考指標評估本地區(qū)胃癌CIMP體系尚屬首次。 三、腫瘤細胞中呈現(xiàn)出基因組整體的低甲基化和局部區(qū)域（抑癌基因、修復基因等）的異常高甲基化，啟動子區(qū)的高甲基化可抑制相應基因的失活，進而導致腫瘤的發(fā)

17、生。對p16、hMLH1、TIMP3、DKK3和E-cadherin五個基因在胃癌組織及細胞系中表達情況的研究證明，基因的表達與其甲基化狀態(tài)基本呈負相關，基因的甲基化狀態(tài)調控并影響著相應基因的表達、表達下調和失活。 四、TIMP3基因在胃癌組織及細胞系中可能存在部分甲基化。應用免疫細胞化學和RT-PCR法對胃病變組織和胃癌細胞系的檢測結果表明TIMP3基因能夠同時存在基因的甲基化和表達，這一結果對DNA的甲基化有了新的認識。而T

18、IMP3基因甲基化與否和甲基化的程度可能與胃癌患者的預后有關。 五、在胃癌的發(fā)生過程中，表觀遺傳學改變較遺傳學改變相比，起到了更為重要的作用，因而未來對胃癌的治療重點也要放到表觀遺傳學方面。用去甲基化劑5-aza-dC處理MGC803和HGC-27兩個細胞系，發(fā)現(xiàn)許多抑癌基因的失活是由于基因甲基化引起的，因而推測不論在胃癌組織還是在胃癌細胞中，抑癌基因表達下調或沉默是相應基因啟動子區(qū)DNA甲基化的結果。這一發(fā)現(xiàn)也為日后胃癌的有效