MAPEG致炎信號通路激活與馬兜鈴酸Ⅰ腎毒性相關(guān)性.pdf

1、第一部分:馬兜鈴酸I致beagle犬腎損傷時MAPEG致炎物質(zhì)生成及相關(guān)蛋白表達特征目的:探索AAI致beagle犬腎損傷時,腎臟炎癥介質(zhì)LTC4和PGE2生成情況及相關(guān)MAPEG家族各蛋白表達特征,并論證其對AAI所致腎臟病理改變的可能機制。方法:健康成年beagle犬8只,雌雄各半?？诜珹AI膠囊(3 mg/kg/day),對照組給予等量空膠囊,連續(xù)給藥10天。每天觀察動物一般狀態(tài),記錄體重變化情況,并在設(shè)定時間點采集血樣尿樣進行

2、分析,用于判斷動物的毒性反應(yīng)。動物于停藥2天后,戊巴比妥鈉麻醉處死。蘇木素-伊紅(Hernatoxylin and eosin, HE)及過碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff, PAS)染色評價腎組織各部位受損情況,透射電鏡檢測腎近端小管細胞的超微結(jié)構(gòu)變化。采用ELISA法分別檢測腎皮質(zhì)和髓質(zhì)內(nèi)cysLTs和PGE2含量。Western blot和免疫組織化學(xué)法考察炎癥介質(zhì)生成相關(guān)MAPEG家族成員FLAP, mGST

3、2、mGST3、LTC4S和mPGES-1在腎組織表達變化及分布特征,并用HPLC法檢測AAI對腎微粒體LTC4合成酶系酶活力的影響。結(jié)果:1.Beagle大連續(xù)口服AAI(3 mg/kg/day),可致體重降低,血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(crea)水平升高,出現(xiàn)尿蛋白,提示AAI已致腎功能損傷。Western blot結(jié)果顯示,AAI引起犬腎組織凋亡終點caspase3蛋白活化,該作用可能與AAI致腎組織線粒體Bax/Bcl-2

4、比值升高有關(guān)。病理學(xué)檢查顯示,AAI對犬的腎毒性部位主要體現(xiàn)在腎皮質(zhì),腎近端小管,表現(xiàn)為腎近端小管上皮細胞腫脹、脫落,小管上皮刷狀緣脫落,線粒體破壞,部分近端小管基底膜裸露。2.該劑量AAI可致犬腎皮質(zhì)cysLTs水平顯著升高,PGE2生成略有降低,而上述炎癥介質(zhì)在腎髓質(zhì)變化不顯著。介導(dǎo)以上炎癥介質(zhì)生成的MAPEG家族成員在腎皮質(zhì)均有廣泛表達但AAI對其影響程度不一,表現(xiàn)為LTC4S和mGST2表達的下調(diào),FLAP和mGST3表達的上調(diào)

5、,且FLAP, mGST3的上調(diào)主要表現(xiàn)在受損嚴(yán)重的腎近端小管上。此外鑒于未見表征mGST2參與催化LTC4特征性亞峰的形成,提示AAI主要通過上調(diào)FLAP, mGST3表達而在犬腎損傷過程中升高cysLTs水平。而對介導(dǎo)PGE2生成的mPGES-1表達在AAI作用后呈現(xiàn)下調(diào)趨勢,與PGE2含量檢測結(jié)果相一致。結(jié)論:Beagle犬口服AAI(3 mg/kg/day)10天,可致腎組織與功能損傷;腎皮質(zhì)是主要受損部位,而腎近端小管細胞是其

6、主要毒性作用靶點。MAPEG家族成員FLAP和mGST3表達上調(diào)伴有cysLTs合成增加;nPGES-1表達下調(diào),推測與PGE2生成減少減弱相關(guān)。提示MAPEG家族成員可影響炎癥介質(zhì)cysLTs和PGE2的生成,參與AAI介導(dǎo)腎毒性的產(chǎn)生。第二部分:MAPEG致炎信號通路激活與馬兜鈴酸I致腎小管上皮細胞損傷相關(guān)性目的:探索MAPEG家族體外介導(dǎo)腎近端小管上皮細胞(LLC-PK1)中兩類炎癥介質(zhì)PGE2、cysLTs生成,及MAPK通路活

7、化對其的調(diào)控作用,論證AAI致腎小管上皮細胞損傷的分子機制。方法:以細胞活力和形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)評價AAI對LLC-PKl細胞的毒性作用,JC-1染色法測定線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,△Ψm), AO/EB和DAPI染色觀察細胞核損傷情況,western blot檢測線粒體依賴凋亡相關(guān)蛋白變化。觀察AAI對細胞MAPEG家族成員表達的時效量效關(guān)系。ELISA法檢測炎癥介質(zhì)cysLTs生成

8、,HPLC法檢測AAI對腎微粒體LTC4合成酶系酶活力的影響,進一步探討mGST2在cysLTs合成中的作用。并通過加入FLAP特異性抑制劑MK886,評價其對AAI致細胞損傷的保護作用。加入外源性PGE2對AAI損傷細胞活力的影響。通過考察上游信號MAPK激活的時效量效變化,并加入ERK活化特異性抑制劑U0126,評價其對AAI致細胞損傷的保護作用,Western blot方法系統(tǒng)評價ERK激活受抑在AAI致細胞損傷時,對MAPEG致

9、炎信號通路的調(diào)控作用。結(jié)果:1.AAI致LLC-PK1細胞FLAP和mGST3表達上調(diào)伴cysLTs水平增加,提示FLAP和mGST3表達與AAI致腎小管損傷存在相關(guān)性,產(chǎn)物cysLTs極有可能參與腎皮質(zhì)損傷;LTC4S表達下調(diào)。HPLC結(jié)果未見mGST2催化LTC4生成的特征性亞峰,提示該酶未參與催化LTC4合成。選擇性FLAP抑制劑MK886可減輕AAI所致細胞凋亡。2.AAI可在作用早期降低環(huán)氧合酶通路中mPGES-1表達,外源性

10、PGE2能改善AAI所致腎近端小管細胞活力的降低。3.AAI可影響細胞活性,改變細胞形態(tài),出現(xiàn)核損傷?？梢娫谠缙诮档途€粒體△Ψm,升高Bax/Bcl-2比值,繼而增加線粒體細胞色素C的釋放,激活caspase3活化誘導(dǎo)凋亡。4.AAI可在早期激活細胞ERK磷酸化,抑制P38磷酸化,ERK活化抑制劑U0126可逆轉(zhuǎn)AAI所致細胞凋亡,并調(diào)控炎癥介質(zhì)生成相關(guān)MAPEG家族蛋白在該體系中的表達。結(jié)論:1.AAI可上調(diào)LLC-PK1細胞cysL

11、Ts合成水平,該作用與FLAP和mGST3蛋白表達上調(diào)相平行;抑制FLAP蛋白表達可提高AAI作用后細胞的存活率,提示FLAP和mGST3蛋白表達上調(diào)及cysLTs合成增加,在AAI誘導(dǎo)腎近端小管細胞凋亡中起作用。2.AAI可下調(diào)LLC-PK1細胞mPGES-1表達,提示PGE2減少可能參與AAI損傷腎近端小管。3.AAI可經(jīng)由線粒體依賴途徑介導(dǎo)LLC-PK1細胞凋亡,抑制ERK1/2通路活化可降低AAI致LLC-PK1(?)田胞毒性作