ROS-RhoA在幽門螺桿菌誘導(dǎo)MKN-45細胞肌動蛋白骨架重排中的作用.pdf

1、胃癌是目前全世界死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，侵襲轉(zhuǎn)移是影響胃癌預(yù)后的重要因素。H.pylori感染是誘導(dǎo)胃癌發(fā)生發(fā)展的重要危險因素，也是促進胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)細胞侵襲和遷移能力的增加是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵原因，肌動蛋白骨架重排是腫瘤細胞侵襲和遷移能力增加的重要標志，因此肌動蛋白骨架的重排有可能在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。通過文獻回顧，發(fā)現(xiàn)Rho GTP酶家族的RhoA蛋白在肌動蛋白骨架重排中起重要作用，而RhoA在許多

2、腫瘤中都高表達，且H.pylori感染能夠促進RhoA蛋白活性，同時體外實驗發(fā)現(xiàn)H.pylori感染能夠誘導(dǎo)胃癌上皮細胞肌動蛋白骨架的變化?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是生物體中需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列氧代謝產(chǎn)物，有研究發(fā)現(xiàn)ROS能夠調(diào)控RhoA活性，而H.pylori在感染時能產(chǎn)生大量ROS。H.pylori、肌動蛋白骨架、RhoA及ROS之間關(guān)系到底如何，并沒有明確地實驗說明。因此，假設(shè)H

3、.pylori通過ROS/RhoA來誘導(dǎo)細胞肌動蛋白骨架重排來促進胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，通過本實驗進行驗證。
　　目的：1、觀察H.pylori感染對MKN-45細胞形態(tài)學(xué)及肌動蛋白骨架的影響；2、研究H.pylori感染對MKN-45細胞侵襲和遷移能力的影響；3、探討RhoA蛋白在H.pylori誘導(dǎo)MKN-45細胞肌動蛋白骨架變化及在侵襲和遷移中的作用；4、探討H.pylori感染MKN-45細胞后所產(chǎn)生的ROS對RhoA蛋白

4、活性的影響。
　　方法：1、H.pylori與MKN-45細胞共培養(yǎng)，制作H.pylori體外感染MLN-45細胞模型，倒置相差顯微鏡觀察MKN-45細胞被感染后形態(tài)學(xué)改變，phalloidin染色觀察肌動蛋白骨架的變化；2、Transwell法檢測H.pylori對MKN-45細胞侵襲力的影響，劃痕實驗檢測H.pylori對MKN-45細胞遷移能力的影響；3、RT-PCR法檢測H.pylori感染后不同時間點（0min、15mi

5、n、30min、60min、180min、360min）RhoA mRNA表達量；GST及western-blot法檢測RhoA蛋白活性。4、siRNA方法干擾RhoA表達，通過phalloidin染色、transwell實驗檢測H.pylori感染后肌動蛋白骨架及侵襲力的影響。5、流式細胞儀檢測H.pylori感染后不同時間點（0min、15min、30min、60min、180min、360min）ROS的表達；NAC干預(yù)（60mi

6、n）H.pylori感染的MKN-45細胞后，檢測ROS下降對RhoA蛋白活性的影響。
　　結(jié)果：1、H.pylori（MOI100：1）與MKN-45共培養(yǎng)后，MKN-45細胞顯著伸長并有突起伸出，分散生長，細胞間連接減少，呈現(xiàn)典型“蜂鳥表型”；phalloidin對F-actin染色后發(fā)現(xiàn)，伸長結(jié)構(gòu)及突起為肌動蛋白骨架，分析細胞長徑與寬徑比值（L/B）后發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染組比值為4.82±1.165，而PBS對照組比值

7、為1.28±0.22；2、Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，100倍鏡下，H.pylori感染組穿膜細胞數(shù)為1600.5±109.6，而PBS對照組為491.0±58.6，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；劃痕實驗分析發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染組劃痕愈合面積為15.1±2.8％，而PBS對照組為4.9±2.3％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；3、RT-PCR檢測H.pylori感染MKN-45細胞各時間點（0min、15min、30min

8、、60min、180min、360min）RhoA mRNA表達量，發(fā)現(xiàn)mRNA表達量并不隨時間遞增，GST和western-blot實驗檢測RhoA蛋白活性（RhoA-GTP/total RhoA）隨時間依次遞增；4、應(yīng)用RNAi干擾MKN-45細胞RhoA表達后，Transwell實驗顯示MKN-45RhoA+PBS對照組穿膜細胞為54.3±6.1個，MKN-45RhoA+H.pylori組為65.0±7.6個，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異

9、（P＞0.05）；phalloidin染色顯示，RhoA表達下降后，MKN-45細胞形態(tài)多為不規(guī)則形，細胞間連接少，H.pylori感染后，只有少部分細胞伸長變型，MKN-45RhoA+PBS對照組L/B結(jié)果為1.5±0.18倍，MKN-45RhoA+H.pylori組結(jié)果為1.73±0.85，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；5、流式細胞儀（DCFH-DA探針）檢測H.pylori感染MKN-45細胞后各時間點（0min、15mi

10、n、30min、60min、180min、360min）ROS熒光強度，結(jié)果顯示熒光強度隨感染時間依次增強；NAC預(yù)處理MKN-45細胞1h后（特異抑制ROS），H.pylori感染MKN-45細胞6h后RhoA蛋白活性為0.57±0.05，PBS+H.pylori感染組蛋白活性為0.82±0.03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：1、H.pylori感染在體外能夠促進胃癌上皮細胞的伸長變型及肌動蛋白骨架的重排，且H