線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ功能抑制對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元高壓激活鈣通道的作用及機(jī)制.pdf

1、線粒體是神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生能量物質(zhì)ATP的重要細(xì)胞器,ATP的合成依賴于線粒體中四個(gè)呼吸鏈復(fù)合體的電子傳遞作用。在缺氧情況下線粒體的功能受到了抑制,呼吸鏈的四個(gè)復(fù)合體的功能也受到了抑制,從而導(dǎo)致ATP合成減少和氧自由基的生成增加。這一系列變化尤其是氧自由基的生成增加會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)基因表達(dá)的變化,離子通道功能的變化,遞質(zhì)釋放的變化,細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化等。在這些變化之中我們所關(guān)注的是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ功能抑制后的鈣離子通道功能的變化。
　　

2、已有的研究表明在缺氧情況下線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ是產(chǎn)生氧自由基的主要部位,而且該復(fù)合體在缺氧情況下起到了氧感受器的作用,從而能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞耐受缺氧的能力。這些都說(shuō)明線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ在缺氧過(guò)程中起到了特殊的作用。我們實(shí)驗(yàn)組前期的研究表明該復(fù)合體的功能抑制對(duì)于電壓門(mén)控鈉離子通道的功能會(huì)產(chǎn)生調(diào)控作用。由于電壓門(mén)控的鈉離子通道與神經(jīng)元的興奮性有關(guān),因此該復(fù)合體對(duì)于鈉離子通道的調(diào)控作用就成為其調(diào)節(jié)細(xì)胞在缺氧過(guò)程中耐受缺氧能力的下游通路之一。

3、>　　但是更值得注意的是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ的功能抑制對(duì)于電壓門(mén)控的鈣離子通道是否也存在作用呢?這個(gè)問(wèn)題具有更重要的意義,因?yàn)橐延械拇罅垦芯勘砻麾}離子通道的功能直接影響了缺氧情況下神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的濃度,而神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子濃度的變化與缺氧情況下神經(jīng)元的功能及其生存能力有著密切的聯(lián)系。因此揭示鈣離子通道的功能變化與線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ功能抑制之間的聯(lián)系以及這種聯(lián)系的內(nèi)在機(jī)制是非常有意義的。
　　本課題以線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ兩個(gè)活性中心

4、的特異性抑制劑Antimycin A和Myxothiazol作為工具藥來(lái)模擬缺氧情況下線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ的功能抑制,并進(jìn)而以全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)來(lái)研究線粒體復(fù)合體Ⅲ的功能抑制對(duì)于電壓門(mén)控鈣離子通道的作用及其產(chǎn)生作用的內(nèi)在機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ的抑制劑AntimycinA對(duì)于電壓門(mén)控的鈣離子通道的功能存在抑制作用,而抑制劑Myxothiazol對(duì)于電壓門(mén)控的鈣離子通道的功能存在著增強(qiáng)作用。我們的研究還表明,過(guò)氧化氫的清除劑

5、和羥自由基的生成抑制劑能夠取消Amtimycin A對(duì)于鈣離子通道的抑制作用而超氧陰離子的清除劑能夠取消Myxothiazol對(duì)于鈣離子通道的增強(qiáng)作用。進(jìn)一步的研究表明,廣譜的PKC抑制劑Chelerythrine能夠阻斷Antimycin A和Myxothiazol對(duì)于鈣離子通道的調(diào)控作用。對(duì)于Antimycin A作用機(jī)制的進(jìn)一步研究表明,經(jīng)典型PKC抑制劑Ro318220能夠取消Antimycin A對(duì)于鈣電流的抑制作用;CGP

6、533534μM(PKCβ亞型的抑制劑)也能夠取消Antimycin A對(duì)于鈣電流的抑制作用,而CGP 533530.5μM(PKCβⅡ亞型的抑制劑)卻不能夠取消Antimycin A對(duì)于鈣電流的抑制作用。此外經(jīng)典型PKC激動(dòng)劑Thymeleatoxin能夠模擬Antimycin A對(duì)于鈣電流的抑制作用。以上這些結(jié)果提示Antimycin A是通過(guò)H2O2-羥自由基-cPKC通路(主要是PKCβⅠ)來(lái)發(fā)揮對(duì)于鈣電流的抑制作用的。對(duì)于My

7、xothiazol的機(jī)制研究表明,PKCδ亞型的抑制劑能夠取消Myxothiazol對(duì)于鈣電流的增強(qiáng)作用。此外PKCδ亞型的激動(dòng)劑也能夠模擬Myxothiazol對(duì)于鈣電流的增強(qiáng)作用。以上的這些結(jié)果表明Myxothiazol是通過(guò)超氧陰離子-nPKC通路(主要是PKCδ)來(lái)發(fā)揮對(duì)于鈣電流的增強(qiáng)作用的。
　　由于鈣超載被認(rèn)為是造成缺氧后神經(jīng)元死亡的重要因素之一。而Antimycin A對(duì)于鈣電流存在抑制作用,從而減輕細(xì)胞內(nèi)的鈣超載。

8、因此Antimcyin A就有可能成為細(xì)胞缺氧后的一種保護(hù)機(jī)制。相反,Myxothiazol對(duì)于鈣電流存在增強(qiáng)作用,從而加重細(xì)胞內(nèi)的鈣超載,由此可能成為細(xì)胞缺氧后的一種損傷機(jī)制。為了考察這一假說(shuō),本課題又以氧糖剝脫(OGD)模型為細(xì)胞模型,以細(xì)胞存活率和LDH釋放量為指標(biāo)考察了Antimycin A Myxothiazol對(duì)于缺氧情況下神經(jīng)元損傷的影響作用。結(jié)果顯示Antimycin A能夠減輕OGD對(duì)于神經(jīng)元的損傷作用,而Myxoth