類子癇動(dòng)物模型中炎性反應(yīng)作用的研究.pdf

1、研究背景:
　　子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有疾病，是母胎發(fā)病率和死亡率的主要原因。臨床上，主要表現(xiàn)為母體高血壓、蛋白尿、水腫、伴有或不伴有多器官系統(tǒng)損傷，如腎臟、肝臟、血液系統(tǒng)等；同時(shí)，伴有或不伴有胎兒綜合征（包括胎兒宮內(nèi)生長受限、胎兒宮內(nèi)窘迫、羊水過少、圍產(chǎn)兒發(fā)病率和死亡率增高等）。
　　子癇是在子癇前期基礎(chǔ)上發(fā)生的不能用其它原因解釋的抽搐，其發(fā)生機(jī)制至今仍不明確。據(jù)報(bào)道，子癇在世界范圍內(nèi)發(fā)病率約

2、為1.4％，在發(fā)達(dá)國家子癇導(dǎo)致的孕產(chǎn)婦死亡已很罕見，但在某些欠發(fā)達(dá)地區(qū)，子癇所致的孕產(chǎn)婦死亡率仍高達(dá)15%。終止妊娠通常是重度子癇前期/子癇的唯一有效治療方法。
　　盡管希波克拉底在公元前400年就對(duì)子癇進(jìn)行了描述，但子癇的病因?qū)W研究進(jìn)展緩慢。眾多學(xué)者在上世紀(jì)九十年代嘗試不同方法建立了子癇前期動(dòng)物模型，而目前尚無子癇動(dòng)物模型的相關(guān)報(bào)道，建立一個(gè)具備人類子癇基本特征的動(dòng)物模型，將對(duì)這一疾病的病理生理學(xué)研究及探尋發(fā)病機(jī)制和有效的預(yù)防治

3、療方法具有重要的促進(jìn)作用。
　　第一部分戊四氮誘導(dǎo)類子癇抽搐動(dòng)物模型的建立
　　目的:
　　參照Faas等實(shí)驗(yàn)方法利用極低劑量內(nèi)毒素對(duì)妊娠中期大鼠尾靜脈注射的方法建立子癇前期動(dòng)物模型，運(yùn)用化學(xué)刺激（戊四氮腹腔注射誘導(dǎo)）的方法在子癇前期動(dòng)物模型基礎(chǔ)上建立一個(gè)能夠模擬人類子癇發(fā)病特征的動(dòng)物模型，對(duì)研究子癇發(fā)病機(jī)制、病理生理改變及探尋新的有效治療手段具有重要的意義。
　　材料與方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：

4、r>　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)8-10周齡的SD雌性大鼠（約200-240g）購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，經(jīng)過隔離檢疫并適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后按雌雄大鼠2:1進(jìn)行合籠，次晨行陰道涂片，鏡檢發(fā)現(xiàn)精子者標(biāo)記為妊娠第0天；
　　實(shí)驗(yàn)分組：39只大鼠隨分為以下5組：
　　1)正常非孕對(duì)照組NP(n=6)；
　　2)正常妊娠對(duì)照組P（n=6）；
　　3)子癇前期模型組PE（n=8）；
　　4)類子癇模型組PE-PTZ(n=10)接

5、受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐；
　　5)硫酸鎂治療組 PE-PTZ-Mg(n=9)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐前及硫酸鎂治療。
　　2、子癇前期動(dòng)物模型制作：參照Faas等人先前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法利用極低劑量內(nèi)毒素（l.0 ug/kg體重，生理鹽水溶解配制稀釋為2m1）于大鼠妊娠第14天采用微量注射泵由尾靜脈緩慢泵入，建立子癇前期大鼠模型；正常非孕及正常妊娠對(duì)照組給予等量生理鹽水2ml尾靜脈注射。
　　3、類子癇動(dòng)物模型制作：在

6、子癇前期動(dòng)物模型基礎(chǔ)上大鼠妊娠第16、17、18天采用戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ）腹腔注射的方法誘導(dǎo)抽搐發(fā)生，PTZ劑量通過查閱文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果考慮致癇率及死亡率綜合因素，采用40mg/kg體重。子癇模型組在大鼠妊娠第16、17、18天給予戊四氮40mg/kg體重腹腔注射誘發(fā)抽搐，觀察大鼠抽搐生物學(xué)行為，觀察各組抽搐情況；
　　4、硫酸鎂對(duì)抽搐的預(yù)防作用：根據(jù)先前文獻(xiàn)經(jīng)驗(yàn)，于妊娠第16、17、18天戊四氮

7、注射前20分鐘給予270mg/kg體重硫酸鎂腹腔注射，觀察各組抽搐情況；
　　5、抽搐行為學(xué)記錄：抽搐行為學(xué)分級(jí)參照Racine（1972）經(jīng)典分級(jí)：1級(jí)：靜止、凝視和咀嚼；2級(jí)：點(diǎn)頭、濕狗樣抖動(dòng)及面部抽動(dòng)；3級(jí)：一側(cè)前肢震顫；4級(jí)：站立、雙側(cè)前肢震顫及持續(xù)性點(diǎn)頭；5級(jí)：全身性強(qiáng)直—陣攣性發(fā)作。觀察時(shí)間給藥后30分鐘。記錄指標(biāo)包括，（1）抽搐潛伏期：給藥后到發(fā)生1級(jí)抽搐的時(shí)間；（2）五級(jí)抽搐潛伏期：給藥后到發(fā)生5級(jí)抽搐的時(shí)間；（3

8、）非五級(jí)抽搐持續(xù)時(shí)間：對(duì)30分鐘內(nèi)未發(fā)生強(qiáng)直—陣攣性抽搐的大鼠記錄其由開始1級(jí)抽搐到恢復(fù)平靜的時(shí)間；（4）五級(jí)抽搐時(shí)間：發(fā)生強(qiáng)直—陣攣性抽搐持續(xù)時(shí)間；（5）五級(jí)抽搐發(fā)生率：發(fā)生強(qiáng)直—陣攣性抽搐大鼠數(shù)量占組內(nèi)實(shí)驗(yàn)大鼠總數(shù)的百分比。
　　6、大鼠生理生化指標(biāo)檢測(cè)：妊娠第6、11、14、15、18天上午9:00-12:00間通過無創(chuàng)尾套法測(cè)量大鼠血壓；妊娠第7、12、16、19天通過代謝籠收集大鼠24小時(shí)尿蛋白；非孕大鼠的相關(guān)生理指標(biāo)監(jiān)

9、測(cè)時(shí)間點(diǎn)按同批次孕鼠的相應(yīng)妊娠時(shí)間進(jìn)行。妊娠第19天麻醉大鼠，取下腔靜脈血離心收集血清后全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)谷草氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的水平。終止妊娠，剖宮取胎對(duì)仔鼠及胎盤進(jìn)行計(jì)數(shù)稱重，記錄可見的吸收胚胎及畸形胎兒個(gè)數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，S-W方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x± s)表示，計(jì)

10、數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示。各組間采用方差分析進(jìn)行比較，方差齊性采用最小顯著性差異檢驗(yàn)（LSD），方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。重復(fù)測(cè)量的方差分析(analysis of variance for repeated measures)用于分析血壓、尿蛋白指標(biāo)；率的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。 P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠抽搐行為學(xué)：
　　1)給予戊四氮腹腔注射后，各

11、組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的癇樣抽搐發(fā)作行為，誘發(fā)抽搐時(shí)生物學(xué)行為符合Racine描述的抽搐分級(jí)：給予戊四氮腹腔注射后大鼠活動(dòng)活躍，然后出現(xiàn)靜止、凝視，隨后開始表現(xiàn)為重復(fù)、刻板、持續(xù)性點(diǎn)頭、咀嚼、濕狗樣抖動(dòng)，以及輕度驚厥，出現(xiàn)一側(cè)前肢震顫、雙前肢震顫、站立繼而可能出現(xiàn)全身性強(qiáng)直一陣攣性發(fā)作；
　　2)類子癇模型組抽搐潛伏期73.2±6.6 s，五級(jí)抽搐潛伏期275.4±35.0 s，五級(jí)抽搐時(shí)間41.0±3.5 s，非五級(jí)抽搐時(shí)間58

12、7.0±175.4 s，五級(jí)抽搐發(fā)生率7/10；
　　3)硫酸鎂治療組誘發(fā)抽搐的時(shí)間（181.5±15.4 s）較類子癇模型組（73.2±6.6 s）明顯延長（P<0.01），五級(jí)抽搐時(shí)間明顯縮短（26.7±4.4 vs.47.4±5.4 s, P<0.05），且五級(jí)抽搐發(fā)生率在妊娠第17、18天顯著降低（P<0.01）；
　　2、大鼠生理生化指標(biāo)水平變化：
　　1)類子癇模型組血壓與PE模型組無顯著性差異（P<0.0

13、5），而較正常妊娠組和非孕組明顯增高（P<0.01）；24小時(shí)尿蛋白變化與子癇前期組相同；血清ALT及AST在類子癇模型組明顯增高（P<0.05），Cr和BUN濃度在各組間無明顯差異；
　　2)硫酸鎂治療組血壓、尿蛋白變化趨勢(shì)與類子癇模型組及PE模型組無顯著性差異（P>0.05）；ALT、AST均較類子癇模型組降低，胎盤仔鼠重量較類子癇模型組增高，胚胎吸收率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　

14、1.成功在子癇前期模型基礎(chǔ)上通過戊四氮腹腔注射的方法誘導(dǎo)子癇前期大鼠抽搐，建立類子癇模型；
　　2.硫酸鎂治療后大鼠血壓、尿蛋白未出現(xiàn)明顯改變，但反映臟器功能指標(biāo)明顯降低，妊娠結(jié)局部分改善。
　　第二部分類子癇抽搐動(dòng)物模型中炎性反應(yīng)的作用
　　目的:
　　在戊四氮誘導(dǎo)子癇動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）研究炎性因子在動(dòng)物模型中的變化，探討炎性反應(yīng)與子癇抽搐發(fā)病的關(guān)系。
　　材料與方法:

15、>　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)8-10周齡的SD雌性大鼠（約200-240g）購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，經(jīng)過隔離檢疫并適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后按雌雄大鼠2:1進(jìn)行合籠，次晨行陰道涂片，鏡檢發(fā)現(xiàn)精子者標(biāo)記為妊娠第0天；
　　實(shí)驗(yàn)分組：57只大鼠隨分為以下7組：
　　6)正常非孕對(duì)照組NP(n=6)；
　　7)非孕抽搐組NP-PTZ(n=8)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐；
　　8)正常妊娠對(duì)照組P（n=

16、6）；
　　9)正常妊娠抽搐組P-PTZ(n=8)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐；
　　10)子癇前期模型組PE（n=8）；
　　11)類子癇模型組PE-PTZ(n=10)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐；
　　12)硫酸鎂治療組 PE-PTZ-Mg(n=9)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐前及硫酸鎂治療。
　　2、動(dòng)物模型制作：類子癇模型鼠制作處理如第一部分所述；正常妊娠抽搐組、子癇模型組在大鼠妊娠第16、17、18天，

17、及非孕抽搐組在相應(yīng)天數(shù)給予戊四氮40mg/kg體重腹腔注射誘發(fā)抽搐，觀察大鼠抽搐生物學(xué)行為，觀察各組抽搐情況；硫酸鎂治療組于妊娠第16、17、18天戊四氮注射前20分鐘給予270mg/kg體重硫酸鎂腹腔注射，觀察各組抽搐情況；
　　3、抽搐行為學(xué)記錄：抽搐行為學(xué)分級(jí)參照Racine（1972）經(jīng)典分級(jí)。記錄指標(biāo)包括，（1）抽搐潛伏期：給藥后到發(fā)生1級(jí)抽搐的時(shí)間；（2）五級(jí)抽搐潛伏期：給藥后到發(fā)生5級(jí)抽搐的時(shí)間；（3）非五級(jí)抽搐持續(xù)

18、時(shí)間：對(duì)30分鐘內(nèi)未發(fā)生強(qiáng)直—陣攣性抽搐的大鼠記錄其由開始1級(jí)抽搐到恢復(fù)平靜的時(shí)間；（4）五級(jí)抽搐時(shí)間：發(fā)生強(qiáng)直—陣攣性抽搐持續(xù)時(shí)間；（5）五級(jí)抽搐發(fā)生率：發(fā)生強(qiáng)直—陣攣性抽搐大鼠數(shù)量占組內(nèi)實(shí)驗(yàn)大鼠總數(shù)的百分比。
　　4、大鼠血清炎性因子檢測(cè)：妊娠第19天麻醉大鼠，取下腔靜脈血離心收集血清后ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-1β，血管生成因子sFlt-1、PlGF的血清表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)

19、分析：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，S-W方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x± s)表示，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示。各組間采用方差分析進(jìn)行比較，方差齊性采用最小顯著性差異檢驗(yàn)（LSD），方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠抽搐行為學(xué)：給予戊四氮腹腔注射后，各組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的癇樣抽搐發(fā)作行為，類子癇模型組抽搐潛伏期（73.2±

20、6.6 s）較正常妊娠抽搐組（107.0±7.4 s）及正常非孕抽搐組(122.5±10.4 s)明顯縮短（P<0.01），而五級(jí)抽搐潛伏期，五級(jí)抽搐時(shí)間，非五級(jí)抽搐時(shí)間及五級(jí)抽搐發(fā)生率無顯著性差異；硫酸鎂治療組誘發(fā)抽搐的時(shí)間（181.5±15.4 s）較類子癇模型組（73.2±6.6 s）明顯延長（P<0.01），五級(jí)抽搐時(shí)間明顯縮短（26.7±4.4 vs.47.4±5.4 s, P<0.05），且五級(jí)抽搐發(fā)生率在妊娠第17、18天

21、顯著降低（P<0.01）；
　　2、大鼠血清炎性因子變化：TNF-α, IL-1β, sFlt-1及PlGF濃度在類子癇組達(dá)最高，而硫酸鎂治療后明顯下降。硫酸鎂治療后 TNF-α, sFlt-1及PlGF均明顯降低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.在類子癇動(dòng)物模型中觀察到子癇前期大鼠較正常妊娠及正常非孕大鼠抽搐閾值降低，硫酸鎂治療后，大鼠抽搐閾值增高；
　　2.子癇前期模型鼠炎性因子水平較正常妊娠及

22、正常非孕大鼠明顯升高，硫酸鎂治療后大鼠炎性因子均明顯降低。推測(cè)戊四氮誘發(fā)抽搐閾值的降低可能與炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度有關(guān)。
　　第三部分水通道蛋白（AQP4）在類子癇模型鼠海馬組織中的表達(dá)
　　目的:
　　水通道蛋白4（AQP4）是構(gòu)成腦組織中水通道蛋白的主要成分，參與癇樣抽搐發(fā)病，通過免疫組化、western blot方法、熒光定量PCR方法研究AQP4在類子癇模型鼠海馬組織中的表達(dá)情況，探討其在子癇發(fā)病中的作用。

23、　　材料與方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：具體條件如第一、二部分所述。
　　實(shí)驗(yàn)分組：34只大鼠隨機(jī)分為以下4組：
　　1）正常非孕對(duì)照組NP(n=8)；
　　2）正常妊娠對(duì)照組P（n=8）；
　　3）子癇前期模型組PE（n=8）；
　　4）類子癇模型組E(n=10)接受戊四氮腹腔注射誘發(fā)抽搐。
　　2、子癇前期及類子癇動(dòng)物模型建立：具體條件如第一、二部分所述。
　　3

24、、取材：妊娠第19日過量麻醉處死實(shí)驗(yàn)大鼠，采用斷頭法取得腦組織，冰上操作快速分離海馬組織，一側(cè)迅速放入液氮快速冷凍，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫涣硪粋?cè)放入中性福爾馬林固定用于制作蠟塊。
　　4、采用免疫組化對(duì)AQP4蛋白在海馬組織中進(jìn)行定位及半定量檢測(cè)。熒光定量PCR法檢測(cè)海馬組織中AQP4的表達(dá)，采用相對(duì)定量方法比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品或內(nèi)參樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異。Western blot法檢測(cè)海馬組織中AQP

25、4的表達(dá)，用Quantity One軟件對(duì)蛋白免疫印跡條帶進(jìn)行分析，計(jì)算目的條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值并進(jìn)行比較。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，S-W方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x± s)表示，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示。各組間采用方差分析進(jìn)行比較，方差齊性采用最小顯著性差異檢驗(yàn)（LSD），方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。重復(fù)測(cè)量的方差分析(analysis of va

26、riance for repeated measures)用于分析血壓、尿蛋白指標(biāo)；率的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。 P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠海馬組織AQP4免疫組化結(jié)果顯示陽性染色呈棕褐或棕黃色，沿血管壁或者細(xì)胞膜分布。正常非孕鼠陽性染色顆粒較少見，正常妊娠組AQP4陽性染色相比非孕鼠增加，PE及類子癇模型鼠中表達(dá)明顯增多。
　　2、QPCR相對(duì)定量結(jié)果提示AQP4

27、在PTZ誘發(fā)抽搐大鼠海馬組織中的表達(dá)明顯升高，其中類子癇模型組、子癇前期組明顯高于正常妊娠組和非孕組（P<0.05），而正常妊娠組及非孕組間AQP4表達(dá)量無明顯差異（P>0.05）。
　　3、Western-blot灰度比值分析結(jié)果提示AQP4在正常妊娠和非孕組表達(dá)無明顯差異，而在子癇前期及類子癇模型組明顯升高（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　AQP4在類子癇大鼠及 PTZ誘發(fā)抽搐的大鼠海馬組織中的表達(dá)明顯增加，可能