香煙煙霧致BEAS-2B細(xì)胞惡變過(guò)程中表觀遺傳改變研究.pdf

1、目的：對(duì)永生化的人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)進(jìn)行體外香煙煙霧染毒,建立細(xì)胞體外染毒惡性轉(zhuǎn)化模型,觀察BEAS-2B細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中相關(guān)抑癌基因的啟動(dòng)子甲基化情況和mRNA表達(dá)情況以及相關(guān)甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)情況,探究香煙煙霧致肺癌的發(fā)生機(jī)制,為篩選香煙煙霧致肺癌的早期分子標(biāo)志物提供理論依據(jù)。
　　方法：采用永生化的人支氣管上皮細(xì)胞株(BEAS-2B細(xì)胞)進(jìn)行體外染煙,在BEAS-2B細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),以5×104

2、每皿的量接種于Transwell膜培養(yǎng)皿中培養(yǎng),次日將Transwell膜培養(yǎng)皿置于細(xì)胞氣體染毒裝置進(jìn)行香煙煙霧染毒,染毒裝置的氧氣濃度恒定在21％,水浴維持染毒腔溫度為37℃,結(jié)合文獻(xiàn)以及CCK-8結(jié)果確定合適的香煙煙霧染毒濃度以及染毒時(shí)間。細(xì)胞連續(xù)染毒兩次作為染毒一代,共染毒30代,傳代40代。分別檢測(cè)對(duì)照組和染毒代1代、10代、20代、30代細(xì)胞及各自傳代40代后其周期和凋亡率,ROS水平以及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)等細(xì)胞

3、惡性轉(zhuǎn)化的指標(biāo)。用Q-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)情況。用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞以及Sm20-40和Sm30-40中RASSF1A、p16、RARβ、hMLH1、FHIT以及重復(fù)序列LINE-1基因的甲基化狀況并檢測(cè)RASSF1A、p16和FHIT基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴CCK-8結(jié)果:CCK-8數(shù)據(jù)顯示隨著染煙濃度以及時(shí)間增加,細(xì)胞增殖抑制率也在不

4、斷上升,最終我們選擇的染煙濃度為20％,染煙時(shí)間是10分鐘,在此條件下,細(xì)胞染煙后增殖抑制率在30％左右。⑵基礎(chǔ)指標(biāo)檢測(cè):各染毒組細(xì)胞G1期比例均有所降低(P<0.05),S期細(xì)胞比例均有所上升(P<0.05)。細(xì)胞第一次染毒后凋亡率明顯升高(P<0.05),但在染毒后期傳代的細(xì)胞凋亡率明顯降低,從 Sm20-40到 Sm30-40,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各染毒組細(xì)胞與對(duì)照組相比,ROS水平均出現(xiàn)上升趨勢(shì),且隨著染毒代數(shù)增加,出現(xiàn)

5、劑量效應(yīng)關(guān)系。⑶細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化程度:細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,BEAS-2B細(xì)胞在軟瓊脂中有較小的克隆形成率,在10％左右,但隨著細(xì)胞染毒代數(shù)的增加以及傳代,軟瓊脂克隆形成率逐漸增高,染毒30代克隆形成率最高,可達(dá)50％以上(P<0.05)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明染毒30代并傳代40代的BEAS-2B細(xì)胞已具有體外裸鼠成瘤能力,Sm30-40細(xì)胞裸鼠成瘤率達(dá)到40％。分離瘤體做病理分析可見瘤細(xì)胞大小不一,呈彌漫性分布,異型性,為低分化癌,

6、對(duì)照組裸鼠瘤體病理分析未見異型性明顯的細(xì)胞。⑷基因表達(dá)以及甲基化狀況:染毒并傳代組細(xì)胞出現(xiàn)了DNMT1表達(dá)量下降的情況(P<0.05);而相反的,染毒組細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組,DNMT3a表達(dá)量有不同程度的升高(P<0.05),到染毒后期最高,呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。對(duì)RASSF1A、p16、RARβ、hMLH1、FHIT和LINE-1基因啟動(dòng)子特異位點(diǎn)的甲基化狀況檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):對(duì)照組細(xì)胞 RASSF1A、FHIT基因沒(méi)有甲基化的表達(dá),而染毒組細(xì)

7、胞出現(xiàn)高甲基化狀態(tài);LINE-1在對(duì)照組細(xì)胞中出現(xiàn)高甲基化狀態(tài),而在染毒組細(xì)胞中呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)論：①確定了最佳染毒濃度以及時(shí)間,成功建立了體外染煙致BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的模型。②染毒后細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞增殖失控,具備了惡性特征且具有裸鼠成瘤性。③抑癌基因RASSF1A和FHIT啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)高甲基化狀態(tài),重復(fù)序列LINE-1則出現(xiàn)低甲基化狀態(tài),同時(shí)基因RASSF1A和FHIT的表達(dá)在染毒組發(fā)生了改變,這可能是香煙煙霧染