人腦鈉素檢測試劑的研制及應(yīng)用研究.pdf

1、目的： 腦鈉素(Brainnatriureticpeptide，BNP)是主要由心房和心室肌細(xì)胞合成的神經(jīng)肽類激素，起初為134個(gè)氨基酸組成的多肽片段，隨后被加工成為108肽的前體(pro-BNP)。pro-BNP被酶裂解成為氨基端76肽(NT-pro-BNP)與具有生物活性的羧基端32肽(BNP-32)。在病理狀態(tài)下，左心室收縮強(qiáng)度增加或容量負(fù)荷壓力增大是BNP生成和釋放的主要調(diào)節(jié)因素。 BNP作為一種具有排鈉、利尿、

2、舒張血管作用的神經(jīng)肽類激素，在臨床上，有助于評估心室的修復(fù)效果、心肌肥厚和收縮強(qiáng)度等。研究已證實(shí)了BNP與急、慢性心衰、急性心梗等多種心血管疾病的早期診斷、鑒別診斷、病理分期、預(yù)后評價(jià)及治療關(guān)系密切。 目前，臨床上檢測BNP通常運(yùn)用抗BNP單克隆或多克隆抗體建立起來的免疫學(xué)測定方法，如放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)，微粒子酶免疫法(MEIA)，熒光免疫法(FIA)等。但一些方法存在放射性污染，一些方法所需試劑、儀器依靠

3、進(jìn)口，成本昂貴，限制了其在臨床上廣泛應(yīng)用。本研究針對這一問題，運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)室的優(yōu)勢條件，擬研究開發(fā)一種成本低廉的非競爭法的檢測BNP的ELISA試劑盒，改變BNP檢測試劑依賴進(jìn)口的局面，并且具有與進(jìn)口試劑相比有等同的靈敏度和特異性。期望BNP的檢測在基層醫(yī)療單位上作為輔助診斷手段得以廣泛應(yīng)用。 方法： 采用基因工程合成的BNP抗原，以夾心ELISA法為檢測策略，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)方法，對各種檢測條件如包被抗體的稀釋度，檢測抗體的

4、稀釋度，BNP抗原的稀釋度，血清反應(yīng)時(shí)間，酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化分析。在優(yōu)化的條件基礎(chǔ)上以BNP標(biāo)準(zhǔn)品評估試劑盒的線性檢測范圍，制作質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。在確定了所有的條件以后，確定了各種試劑的工作濃度，用我們研制的ELISA檢測試劑檢測150例臨床樣本(病例NYHA分級為Ⅰ～Ⅳ級)，同時(shí)與羅氏產(chǎn)品的檢測效果進(jìn)行比較，以評價(jià)本實(shí)驗(yàn)試劑盒的靈敏度和特異性。 結(jié)果： 1.經(jīng)優(yōu)化和篩選后，建立了定量檢測BNP的雙抗夾心ELISA系

5、統(tǒng)。 (1)包被濃度及時(shí)間：BNP包被單克隆抗體的濃度為50ng/mL，包被條件為4℃濕盒內(nèi)過夜，37℃反應(yīng)1h。 (2)封閉：封閉液為3％BSA，封閉時(shí)間為37℃反應(yīng)1.5h。 (3)抗原反應(yīng)時(shí)間：待測樣本(BNP抗原反應(yīng)的時(shí)間)采用1:10稀釋，37℃反應(yīng)45min。 (4)酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間：酶標(biāo)抗體的使用濃度為100ng/mL，37℃反應(yīng)1h。 (5)顯色反應(yīng)：采用常規(guī)的TMB底物液，100

6、μL/孔，37℃避光反應(yīng)20min。 (6)終止反應(yīng)：加入常規(guī)終止液50μL/孔，終止反應(yīng)，靜置5min。 2.通過優(yōu)化的BNP雙抗體夾心法檢測系統(tǒng)，以BNP標(biāo)準(zhǔn)品為檢測對象，確定該系統(tǒng)的檢測線性范圍為11～1280pg/ml。 3.檢測體系的可靠性評價(jià)：重復(fù)性實(shí)驗(yàn)顯示批內(nèi)變異系數(shù)為6.32％；批間變異系數(shù)為6.12％。批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于10％，符合衛(wèi)生部的臨床試劑檢測標(biāo)準(zhǔn)。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表明加標(biāo)回收率分別為9

7、3.1％、92.4％和89.2％，平均為91.6％，達(dá)到了檢測試劑的要求。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示R2=0.9757，說明所建立的定量檢測BNP的雙抗夾心ELISA系統(tǒng)具有穩(wěn)定性、可靠性。 4.靈敏度和特異度評價(jià)：應(yīng)用本試劑檢測系統(tǒng)檢測150例病例和正常人的血漿，并且與羅氏產(chǎn)品比較，新研制的BNP試劑盒靈敏度和特異度分別為89.3％和95.7％，符合率為91.3％，表明我們研究的雙抗體夾心ELISA試劑盒具有羅氏產(chǎn)品相近的檢測能力。

8、 結(jié)論： 本研究建立了BNP雙抗體夾心法ELISA檢測體系，其檢測BNP的線性范圍為11～1280pg/ml。與目前臨床使用的進(jìn)口羅氏相比其檢測的靈敏度和特異度分別為89.3％、95.7％，符合率為91.3％。證明其檢測的靈敏度和特異度與國外同類產(chǎn)品相當(dāng)，可在3小時(shí)左右完成全部檢測過程。檢測成本相對低廉，能夠?qū)崿F(xiàn)對病人標(biāo)本的準(zhǔn)確檢測，如果能夠進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用到臨床將有希望取代國外進(jìn)口同類試劑，而且由于僅需要酶標(biāo)儀，可以推廣到鄉(xiāng)