帕金森氏病動物模型腦組織及病人血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、帕金森氏病(Parkinson’sDisease，PD)是一種老年人群中高發(fā)的神經(jīng)退行性疾病，以運(yùn)動能力障礙為其主要病理表現(xiàn)，部分患者還伴隨癡呆癥狀。PD的神經(jīng)病理學(xué)特點(diǎn)主要包括黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，紋狀體中多巴胺含量減少以及神經(jīng)元內(nèi)涵體(路易小體，LewyBody，LB)的形成。目前，PD的病理機(jī)制尚未明確，但許多研究顯示為環(huán)境毒素與遺傳因素共同作用的結(jié)果。本文利用MPTP小鼠模型和α-synuclein(A53T)轉(zhuǎn)基因小鼠

2、模型分別模擬了環(huán)境毒素和遺傳因素誘導(dǎo)的PD模型，并結(jié)合PD患者血清樣品，以差異蛋白質(zhì)組學(xué)為主要手段對PD的病理機(jī)制進(jìn)行了研究，試圖發(fā)現(xiàn)與PD發(fā)病相關(guān)的新蛋白和藥物治療新靶標(biāo)。 第一部分MPTP模型小鼠紋狀體的差異蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)研究 環(huán)境毒素是導(dǎo)致散發(fā)性PD的致病因子之一。目前已知可致PD的神經(jīng)毒劑包括MPTP、殺蟲劑(如Rotenon)、除草劑(如Paraquat)和金屬錳等，它們的致病機(jī)制是特異性抑制多巴胺能神經(jīng)元中

3、線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ(ComplexⅠ)或Ⅲ(ComplexⅢ)。其中，MPTP可通過對ComplexⅠ的抑制，誘導(dǎo)C57BL/6小鼠表現(xiàn)出明顯的PD樣病理改變。因此該模型被廣泛應(yīng)用于PD的病理機(jī)制研究。 在本研究中，我們對C57BL/6小鼠連續(xù)7天腹腔注射MPTP后，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對MPTP小鼠和生理鹽水對照組小鼠紋狀體線粒體總蛋白譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)MPTP小鼠蛋白譜中有5個蛋白點(diǎn)顯著改變。其中，4個蛋白點(diǎn)表達(dá)顯著降

4、低，經(jīng)質(zhì)譜鑒定分別為：ZincfingerA20domaincontaining1、Lectin-relatedNKcellreceptorLY49S、Proteinsimilartosodiumchannelassociatedprotein1isoform2和Proteasome19SATPaseRpt6；而另外1個點(diǎn)表達(dá)顯著升高，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為α-synuclein(α-Syn)。 在隨后的研究中，我們集中探討了差異點(diǎn)19S

5、ATPaseRpt6(Rpt6)表達(dá)降低與差異點(diǎn)α-Syn升高問潛在的關(guān)系。已知，26S蛋白酶體復(fù)合物由1-2個19S調(diào)節(jié)單位和1個20S催化單位組成，而19SATPaseRpt6是組成19S調(diào)節(jié)單位的亞基之一，因此提示26S蛋白酶體功能不足可能與α-Syn表達(dá)增加有關(guān)。WesternBlot研究顯示，MPTP小鼠紋狀體Rpt6及其同源亞基Rpt4蛋白水平分別降低約85.0％和30.5％，而20S組成亞基α6無明顯改變，同時α-Syn蛋

6、白表達(dá)增加164.8％。但MPTP小鼠黑質(zhì)中上述蛋白水平均無明顯改變。此外，MPTP還可導(dǎo)致紋狀體ATP濃度顯著降低約36.4％，而對黑質(zhì)中ATP濃度無影響。由于19SATPase亞基的功能是ATP依賴的，因此，在MPTP小鼠紋狀體中ATPase亞基表達(dá)降低和ATP濃度下降可直接導(dǎo)致19S功能障礙。 為進(jìn)一步研究Rpt6減少與α-syn升高間是否具有直接的關(guān)系，我們利用RNA干擾技術(shù)，使用siRNA抑制原代培養(yǎng)的紋狀體神經(jīng)元中R

7、pt6基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，與controlsiRNA組相比，當(dāng)Rpt6蛋白表達(dá)被Rpt6特異siRNA抑制后，神經(jīng)元中α-Syn蛋白水平顯著增加。為揭示Rpt6缺失與20S活性及底物α-Syn聚積的關(guān)系，我們進(jìn)而檢測了黑質(zhì)及紋狀體中20S的三種水解酶活性，即糜蛋白酶、胰蛋白酶和肽水解酶活性。結(jié)果顯示，雖然黑質(zhì)中20S的三種酶活性均被不同程度抑制，但紋狀體中糜蛋白酶活性無明顯改變，同時胰蛋白酶和肽水解酶活性均輕度升高。提示紋狀體中Rpt

8、6的缺失導(dǎo)致α-Syn水平升高，與20S的水解酶功能無直接關(guān)系。 第二部分α-synuclein(A53T)轉(zhuǎn)基因小鼠增齡過程中相關(guān)腦區(qū)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究 α-Syn誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性被認(rèn)為是PD重要病理機(jī)制之一。在家族遺傳性PD患者中己陸續(xù)發(fā)現(xiàn)α-Syn蛋白的三個突變位點(diǎn)，分別為A30P、A53T和E46K。而在散發(fā)性PD患者腦內(nèi)廣泛存在著以α-Syn蛋白為主要結(jié)構(gòu)成分的神經(jīng)元內(nèi)涵體，即路易小體(LBs)和路易神經(jīng)突(

9、LNs)。為揭示α-Syn與PD的關(guān)系，近年來野生型和突變型α-Syn轉(zhuǎn)基因小鼠模型被廣泛應(yīng)用于PD的研究中。 在本部分研究中，我們首先評價了增齡過程中α-Syn(A53T)轉(zhuǎn)基因小鼠與正常對照小鼠行為學(xué)以及特定腦區(qū)的免疫組織化學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)水平的差異。結(jié)果顯示，3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠的行為能力與同齡對照小鼠無差異；而增齡至9月齡后，轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出一定程度的運(yùn)動障礙。同時，3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量以及黑質(zhì)、紋狀體中凋亡細(xì)

10、胞數(shù)量均與對照小鼠無差異；而增齡至9月齡后，轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量呈降低趨勢，黑質(zhì)、紋狀體中凋亡細(xì)胞數(shù)量呈升高趨勢。此外，3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體中HVA含量低于對照小鼠，其他遞質(zhì)如DA和DOPAC無差異；增齡至9月齡后，轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體中DA、DOPAC和HVA均呈降低的趨勢。上述結(jié)果顯示，9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠已處于由生理向病理狀態(tài)過渡的階段。 為進(jìn)一步研究α-Syn過表達(dá)及磷酸化程度與蛋白酶體功能間的關(guān)系，我們利用Wes

11、ternBlot方法檢測了轉(zhuǎn)基因小鼠及同齡對照小鼠黑質(zhì)、紋狀體中α-Syn、CaseinKinaseⅡ(CKⅡ)和19SATPaseRpt6的蛋白表達(dá)，并同時檢測了20S蛋白酶體的水解酶活性。結(jié)果顯示，3月齡和9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠的黑質(zhì)、紋狀體中α-Syn均持續(xù)高表達(dá)。同時，3和9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體中CKⅡ表達(dá)水平均顯著升高，而9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)中CKⅡ表達(dá)水平降低。此結(jié)果提示，9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)和紋狀體中α-Syn的磷酸化水平可能發(fā)

12、生不同的改變。此外，9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)中19SATPaseRpt6表達(dá)水平顯著降低。然而，20S蛋白水解酶活性在3月齡和9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)、紋狀體中均無明顯改變。提示α-Syn持續(xù)高表達(dá)可能首先影響蛋白酶體亞基的表達(dá)水平，但對20S活性無影響。 基于上述結(jié)果，為進(jìn)一步揭示α-Syn(A53T)過表達(dá)相關(guān)的生理病理學(xué)改變，我們采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較了3月齡轉(zhuǎn)基因及同齡對照小鼠，9月齡轉(zhuǎn)基因和同齡對照小鼠黑質(zhì)和紋狀體的蛋白

13、差異譜。 黑質(zhì)組織的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡對照小鼠間存在9個差異蛋白點(diǎn)，其中2個點(diǎn)在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)顯著增加，而另外7個點(diǎn)僅存在于轉(zhuǎn)基因小鼠中。9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與對照小鼠的蛋白差異譜研究共發(fā)現(xiàn)13個差異點(diǎn)，除與3月齡相同的9個差異點(diǎn)外，新出現(xiàn)4個差異點(diǎn)。 紋狀體組織的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡對照小鼠間存在9個差異蛋白點(diǎn)，其中1個點(diǎn)在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)顯著增加，1個點(diǎn)在轉(zhuǎn)基因小鼠

14、中顯著減少，而另外7個點(diǎn)僅存在于轉(zhuǎn)基因小鼠中。9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與對照小鼠的蛋白差異譜研究共發(fā)現(xiàn)11個差異點(diǎn)，除與3月齡相同的9個差異點(diǎn)外，新出現(xiàn)2個差異點(diǎn)。 對比黑質(zhì)及紋狀體的差異蛋白發(fā)現(xiàn)，8個差異點(diǎn)在黑質(zhì)和紋狀體中共同存在。它們在無病理異常的3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠中即己出現(xiàn)，且無組織特異性。此外，9月齡轉(zhuǎn)基因動物黑質(zhì)和紋狀體中分別新出現(xiàn)4個和2個差異點(diǎn)，這些點(diǎn)不僅伴隨動物病理進(jìn)程而出現(xiàn)，且具有組織特異性，因此具有較高的研究價值。

15、 第三部分帕金森病患者與同齡正常人血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究 雖然在老年人群中PD的患病率較高且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，但是目前尚無有效的方法可在PD患者表現(xiàn)出明顯癥狀前對其進(jìn)行預(yù)防和早期診斷。因此，分析生存狀態(tài)下PD患者血液樣本中蛋白質(zhì)的改變情況，以尋找對臨床診斷和機(jī)制研究有價值的生物標(biāo)簽蛋白顯得尤為必要。 由于血液中一些高豐度蛋白(如白蛋白、IgG等)的存在使許多具有重要意義的低豐度蛋白在傳統(tǒng)的二維電泳中不易檢出。因

16、此，我們首先利用Agilent公司的親和抗體柱結(jié)合高效液相系統(tǒng)，同時去除人血清中14種高豐度蛋白質(zhì)，它們約占人血清總蛋白的94％。隨后，我們利用二維電泳技術(shù)對10名男性PD患者及10名同齡男性健康志愿者血清中的低于10％的低豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和差異點(diǎn)分析，并利用MALDI-TOF-TOF技術(shù)對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。 結(jié)果顯示，在PD患者血清樣品中共有16個蛋白點(diǎn)發(fā)生顯著的改變，其中2個點(diǎn)升高，14個點(diǎn)降低。目前已有7個差異點(diǎn)被成功

17、鑒定，質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示這7個差異點(diǎn)為5個已知蛋白質(zhì)。其中，2個點(diǎn)共同鑒定為凝血酶(Thrombin，又名CoagulationfactorⅡ)：2個點(diǎn)共同鑒定為載脂蛋白A-Ⅳ(ApoA-Ⅳ)；1個點(diǎn)為載脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ)；1個點(diǎn)為載脂蛋白L-Ⅰ(ApoL-Ⅰ)；1個點(diǎn)為補(bǔ)體分子2(C2)。這5個蛋白在PD患者血清均中顯著降低。生物信息學(xué)分析提示：由載脂蛋白參與的脂代謝過程，凝血酶參與的凝血系統(tǒng)和C2參與的經(jīng)典補(bǔ)體激活通路可能與