牛痘疫苗致炎皮提取物間質(zhì)細(xì)響研大鼠骨髓充干胞影機(jī)制的究.pdf

1、本研究包括兩部分：
　　 第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化與成骨鑒定
　　 目的:觀察及鑒定體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并向成骨方向誘導(dǎo)分化
　　 方法:取健康成年SD大鼠，全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取MSCs，通過倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征和生長狀況，繪制細(xì)胞生長曲線；培養(yǎng)第2 代MSCs接種后，實(shí)驗(yàn)組加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)液，待MSCs生長至匯合時(shí)，進(jìn)行堿性磷酸酶染色。
　　

2、結(jié)果:分離培養(yǎng)的細(xì)胞在第10～12代以前生長性狀穩(wěn)定，呈成纖維細(xì)胞形態(tài)貼壁生長，增殖能力強(qiáng)；原代培養(yǎng)3～4d后細(xì)胞開始增殖，約7～14d可匯合成片，傳代周期約為5～9d；成骨誘導(dǎo)分化后12～16d可出現(xiàn)較多散在的致密圓形礦化結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶染色可呈陽性，對(duì)照組則未出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)，ALP活性較弱甚至無顯色。
　　 結(jié)論:分離培養(yǎng)的細(xì)胞成分較為單一，具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性，可用于下一步藥物實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分：恩再適對(duì)大鼠

3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖凋亡與成骨分化的影響
　　 目的:探討恩再適對(duì)MSCs增殖凋亡及向成骨細(xì)胞分化的可能影響機(jī)制。
　　 方法:按不同的藥物劑量，將恩再適分為空白對(duì)照組、培養(yǎng)液藥物終濃度為0.1U/ml(低濃度組)、0.5U/ml(中濃度組)和1.0U/ml(高濃度組)共四組，分別干預(yù)培養(yǎng)生長于96孔板中的P3 代MSCs，在第1、3、5、7、9、11d 進(jìn)行MTT 測(cè)定，第2、4、6、8、10、12d 進(jìn)行堿性磷酸酶活

4、性測(cè)定；分別干預(yù)培養(yǎng)生長于六孔板中的P3 代MSCs共3d，進(jìn)行流式DNA周期分析及Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)凋亡分析；分別干預(yù)培養(yǎng)生長于六孔板中的P3 代MSCs，在第3、7、12d 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)Ⅰ型膠原(α2)鏈Col-I mRNA、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)mRNA及骨鈣素(OC)mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果:在干預(yù)早期(＜1周)恩再適對(duì)MSCs的增殖分化均無明顯影響，甚至促進(jìn)