重組腺病毒AD-FLT-1-PC對(duì)糖尿病腎病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本研究旨在探索靶向增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C(PC)表達(dá)對(duì)糖尿病腎病伴動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的保護(hù)作用。通過(guò)以重組腺病毒為載體，將帶有綠色報(bào)告基因及內(nèi)皮細(xì)胞特異性的重組腺病毒Ad-FLT-1/PC，以尾靜脈注射的方式導(dǎo)入糖尿病腎病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠體內(nèi)，觀察目的基因PC在血管壁的分布、表達(dá)以及活化為APC的情況。從細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的角度，深入研究APC對(duì)糖尿病腎病動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制，為糖尿病腎病伴動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)措施提供一

2、定的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建糖尿病腎病(DN)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型SD大鼠，雄性，體重180-200g，隨機(jī)分成正常對(duì)照組和模型組。模型組高脂飲食1月后，腹腔注射STZ40mg/kg，正常組正常飲食1月后，注射同等量的PBS。以7天血糖≥16.7mmol/l為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)。成模大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飲食至16周。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血糖、血脂、尿蛋白、血肌酐、血尿素氮、血漿APC的變化以及腎臟與血管的病理改變。

3、>　　 2.研究重組腺病毒Ad-FLT-1/PC對(duì)DN動(dòng)脈粥樣硬化的作用將成模大鼠隨機(jī)分成三組:Ad-FLT1/PC組(23只)、Ad-GFP組(23只)及NS組（22只），并以正常SD大鼠作為對(duì)照(23只)。分別在轉(zhuǎn)染后1天、3天、7天及14天，每組隨機(jī)取5-6只大鼠處死，快速冰凍切片觀察血管壁熒光分布，分別用RT-PCR、免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)PC mRNA及PC蛋白在血管壁上的表達(dá)情況，ELISA檢測(cè)血漿中蛋白C的活化水

4、平;IHC檢測(cè)血管壁TNF-a、ICAM-1蛋白的表達(dá)量;TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;WST法及TBA法分別檢測(cè)血漿SOD、MDA含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.實(shí)驗(yàn)大鼠基本情況:實(shí)驗(yàn)過(guò)程共有11只大鼠死亡，未成模有8只，68只大鼠造模成功。成模大鼠血糖增高明顯，出現(xiàn)明顯的“多飲、多食、多尿及體重減輕”等癥狀。且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，血脂、尿蛋白、血肌酐及血尿素氮等指標(biāo)較正常組出現(xiàn)明顯異常。造模第8周，腎臟從輕度系膜增生到后

5、期的基底膜增厚，毛細(xì)血管腔狹窄;造模第12周，血管壁開始出現(xiàn)AS病變，至16周末，血管內(nèi)膜明顯增厚，平滑肌細(xì)胞增生明顯，排列紊亂，甚至出現(xiàn)管腔狹窄的表現(xiàn)。
　　 2.通過(guò)尾靜脈注射重組腺病毒Ad-FLT-1/PC后，3天可觀察到綠色熒光在血管內(nèi)皮層表達(dá)，且熒光至少能持續(xù)表達(dá)至14天;轉(zhuǎn)染后1天到14天，RT-PCR可檢測(cè)Ad-FLT-1/PC組血管壁均有不同程度的PCmRNA的表達(dá)，余三組未見其表達(dá)。IHC顯示轉(zhuǎn)染Ad-FLT1

6、/PC重組腺病毒3天后，可見血管內(nèi)皮層PC表達(dá)量增加，均明顯高于Ad-GFP組與NS組水平(P＜0.05);轉(zhuǎn)染1天、3天、7天及14天4個(gè)觀察點(diǎn)，Ad-FLT-1/PC組血漿APC水平均比Ad-GFP組與NS組升高（P＜0.05）。
　　 3.血管壁TNF-a、 ICAM-1的檢測(cè):轉(zhuǎn)染7天后，IHC顯示Ad-FLT1/PC組血管壁的TNF-a、 ICAM-1顯著低于Ad-GFP組與NS組(P＜0.05); GFP組與NS組之

7、間各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)差異（P＞0.05）。
　　 4.血管壁細(xì)胞凋亡的檢測(cè):在各時(shí)間點(diǎn)，正常組幾乎未見細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而Ad-FLT1/PC組、GFP組及NS組均可在血管壁上觀察到細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且各時(shí)間點(diǎn)凋亡發(fā)生率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 5.轉(zhuǎn)染14天后，Ad-FLT-1/PC組血漿SOD的量較Ad-GFP組及NS組增高(P＜0.05)，而血漿MDA的量較其2組含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。