特異性置換肽對銀屑病動物模型作用的研究.pdf

1、銀屑病是一種發(fā)病率高、易反復、治療困難的慢性炎癥性皮膚病，角質(zhì)形成細胞(KC)的過度增殖為其顯著特點。雖然銀屑病的發(fā)病機制尚未完全清楚，但一定的遺傳背景、感染作為誘因、以T細胞為主的細胞免疫紊亂是其發(fā)病機理中的三個主要環(huán)節(jié)。角蛋白(keratin)是哺乳動物細胞骨架的中間纖維家族的主要成員之一，是上皮組織的細胞骨架成份，也是上皮組織的標記蛋白。角蛋白17(K17)是I型角蛋白，在正常表皮不表達，是銀屑病皮損高表達的標記蛋白，并且與鏈球菌

2、M蛋白具有交叉抗原特性，可特異刺激銀屑病T細胞使之活化、釋放IFN-γ等炎癥因子，而后者又能夠誘導增加CKRT17的表達，使機體產(chǎn)生針對CKRT17的自身免疫反應，從而在CKRT17和T細胞之間形成了一個相互促進的惡性環(huán)路，導致炎癥反應和KC異常增生等病理改變，是銀屑病發(fā)病機理中的重要環(huán)節(jié)。CKRT17的特異性置換肽(APL)是一種利用氨基酸替換技術來修飾具有免疫原性的肽而獲得的，它在不影響肽原有的與特定MHC結合能力的基礎上而發(fā)揮免疫

3、調(diào)節(jié)作用。 本研究在以往細胞和器官水平上篩選得到CKRT17的置換肽的基礎上，構建置換肽的GST融合表達載體pGEX-4T-S12E，利用還原型谷胱甘肽及尿素濃度梯度透析法獲得較高純度的APL，觀察APL上清對銀屑病動物模型的治療作用，為進一步闡明銀屑病的免疫學發(fā)病機理和研究銀屑病特異性生物治療提供一定的實驗依據(jù)。 主要實驗方法及結果如下： 一、CKRT17的限制性T細胞表位置換肽的克隆、表達和純化 1.

4、根據(jù)角蛋白17表位S1(118-132)上所對應的置換肽S12E核酸序列，人工合成兩條DNA序列，將其插入到pGEX-4T-1載體相應位點之間，構建GST融合表達載體pGEX-4T-S12E，酶切鑒定并測序。 2.轉化菌經(jīng)IPTG誘導表達，按常規(guī)方法收菌，冰浴中用超聲波破碎細菌，利用還原型谷胱甘肽及尿素濃度梯度透析法進行目的肽段的回收純化，進行SDS-PAGE和WesternBlot分析鑒定。 二、單一核細胞的分離和純化

5、及轉移性 制備以淋巴細胞分離液常規(guī)分離銀屑病患者外周血單一核細胞，淋巴細胞培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度，分別加入置換肽S12E100μg/mL及10μg/mL、GST蛋白(陰性對照)，置于5％CO2孵箱37℃培養(yǎng)72h，標記后-80℃保存?zhèn)溆谩?三、APL對豚鼠銀屑病樣動物模型的治療作用 1.應用5％心得安乳劑制備豚鼠耳廓銀屑病樣皮損模型。 2.將制成的置換肽S12E100μg/mL及10μg/mL、0.

6、1％他克莫司軟膏(陽性對照)、GST蛋白(陰性對照)、乳劑基質(zhì)、淋巴細胞培養(yǎng)液、CKRT17表位上清七種藥物分組外涂于皮損處連續(xù)20d。將不同時間的皮損制成組織切片，常規(guī)HE染色。治療前結果顯示大部分標本見到角化過度，顆粒層減少，棘層肥厚，表皮突延伸呈棒狀，乳頭上伸呈杵狀，4毛細血管擴張。治療后表皮趨于正常。 3.PCNA及CKRT17免疫組化染色PCNA免疫組化染色見陽性細胞的細胞核呈棕黃色。APL組治療作用明顯優(yōu)于陽性對照組

7、，且APL100μg/mL組治療效果優(yōu)于10μg/mL組和他克莫司組，治療時間越長，好轉的程度越明顯。CKRT17免疫組化染色結果顯示表皮及毛囊均有CKRT17蛋白表達，局部外用APL可下調(diào)CKRT17蛋白的表達，高濃度的APL治療作用更明顯。 4.利用ELISA檢測不同時間的豚鼠耳廓血清中IFN-γ的濃度，觀察置換肽對豚鼠耳廓銀屑病樣皮損的治療作用。其結果顯示血清IFN-γ的濃度隨著治療時間的延長而下降。APL100μg/mL