基于可控表面的納米電紡絲技術(shù)的軟骨細(xì)胞表型及其向纖維軟骨分化的研究.pdf

1、軟骨細(xì)胞作為軟骨組織在軟骨基質(zhì)中唯一存在的特定的細(xì)胞種類(lèi)，在軟骨組織再生與代謝方面起到了重要作用。但是由于軟骨組織中缺少血管和神經(jīng)系統(tǒng)，軟骨在自身修復(fù)方面存在一定的局限性。針對(duì)軟骨細(xì)胞的重要性和局限性，目前新興了一種新的概念-生物組織工程學(xué)。它將工程學(xué)、生命科學(xué)和材料學(xué)相結(jié)合，構(gòu)建人體組織或器官的功能替代物，從而在體外更精確的模擬生物體內(nèi)環(huán)境并研究其功能。生物組織工程學(xué)對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)方面有重要意義，其所構(gòu)建的生物支架材料可以為特定的細(xì)胞模

2、擬體內(nèi)三維結(jié)構(gòu)支撐，不僅為組織再生提供模板，還可以更好的研究各種影響因子對(duì)于組織再生和控制組織結(jié)構(gòu)方面的影響。組織工程利用體外構(gòu)建帶有特定功能的軟骨組織再移植入體內(nèi)的治療方法，為軟骨修復(fù)治療提供了可能。由于軟骨細(xì)胞在普通的二維培養(yǎng)模式下容易失去表型而向纖維細(xì)胞表型分化，失去了軟骨的特定功能，因此在體外保持軟骨的表型的研究對(duì)于臨床應(yīng)用有十分重要的意義。半月板在膝關(guān)節(jié)內(nèi)起著重要作用，維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，均衡傳導(dǎo)負(fù)荷，吸收剪切應(yīng)力，潤(rùn)滑關(guān)節(jié)并

3、為其提供營(yíng)養(yǎng)。半月板為纖維軟骨結(jié)構(gòu)，由軟骨細(xì)胞和膠原纖維基質(zhì)構(gòu)成，體內(nèi)纖維軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)多成平行排列。體外構(gòu)建具有功能的纖維軟骨具有重要的臨床研究意義。
　　目前在生物組織工程的應(yīng)用方面，納米材料正成為一種新的研究趨勢(shì)，納米技術(shù)的應(yīng)用也更加被人們所重視。電紡絲在制備納米纖維材料方面有著特定優(yōu)勢(shì)，相比其他技術(shù)，它更加簡(jiǎn)便有效。它是在強(qiáng)電場(chǎng)的環(huán)境下將聚合物溶液形成噴流并進(jìn)行紡絲加工的技術(shù)。這門(mén)技術(shù)所需的制作設(shè)備簡(jiǎn)易，而且也能更高效的

4、控制紡絲的形狀和結(jié)構(gòu)從而制備特定物理結(jié)構(gòu)和功能的紡絲制品。由電紡絲技術(shù)制備的紡絲纖維表面積大，孔隙率高，纖維纖度細(xì)，這些特點(diǎn)可為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供不同結(jié)構(gòu)的多孔支架，利于特定細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。因此電紡絲技術(shù)已越來(lái)越多的被應(yīng)用于納米技術(shù)和納米材料的制備，并在生物組織工程領(lǐng)域起著很重要的作用。
　　目的:建立一種簡(jiǎn)易可控的不同電紡絲表面的平臺(tái)用于軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)，并很好的維持軟骨細(xì)胞的表型，利用平行的納米電紡絲構(gòu)建了纖維軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的

5、模型培養(yǎng)軟骨細(xì)胞并讓其向纖維軟骨分化。
　　方法:
　　1.大鼠原代軟骨細(xì)胞的提取
　　2.制作聚乳酸乙醇酸(Poly-(lactic-co-glycolic) acid，PLGA)納米紡絲:電壓:7.5kV流體速度:8μl/min。
　　3.利用了不同表面結(jié)構(gòu)（平行和垂直方向）的納米電紡絲來(lái)研究軟骨細(xì)胞在紡絲上的形態(tài)，行為和功能。平面的玻璃表面作為對(duì)照組，軟骨細(xì)胞在平面玻璃，平行電紡絲，垂直電紡絲3種表面生長(zhǎng)7

6、天后，通過(guò)免疫熒光染色表征Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)，同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量PCR在基因水平上鑒定以上3種基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.電鏡鑒定PLGA納米電紡絲的直徑為:200納米。
　　2.軟骨細(xì)胞在平的玻璃表面生長(zhǎng)呈現(xiàn)多角形，在平行電紡絲上細(xì)胞生長(zhǎng)在紡絲之間，在垂直電紡絲上細(xì)胞可長(zhǎng)在表面和紡絲之間。
　　3.免疫熒光染色:軟骨細(xì)胞在不同的表面生長(zhǎng)7天后，在蛋白水平上Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原和蛋白多糖存在差異

7、，其中，在平行納米電紡絲表面，軟骨細(xì)胞3種蛋白的表達(dá)全部上調(diào)，而垂直的納米電紡絲表面只有Ⅱ型膠原表達(dá)上調(diào)。
　　4.基因分析:利用實(shí)時(shí)定量PCR分析Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原和蛋白多糖3種基因的表達(dá)差異，以平面玻璃的表面實(shí)驗(yàn)組作對(duì)照組，進(jìn)行相對(duì)定量。其中，在平行納米電紡絲表面，軟骨細(xì)胞Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原和蛋白多糖3種基因的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　軟骨細(xì)胞在平行的納米電紡絲表面上能提高Ⅱ型膠原與蛋白多糖的表達(dá)，同時(shí)也能顯