鯉皰疹病毒II型微載體培養(yǎng)技術與滅活疫苗浸泡免疫效果研究.pdf

1、鯽（Carassius auratus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，在我國水產養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。鯽造血器官壞死癥是目前危害養(yǎng)殖鯽最為嚴重的病毒性疾病，其病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2）。鯽造血器官壞死癥流行范圍廣、傳染性強，死亡率高，給鯽養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經濟損失。目前，鯽造血器官壞死癥尚缺乏有效的防控和治療方法。疫苗免疫被認為是預防水產養(yǎng)殖動物傳染性疾病特別是病毒性疾病最為有效的方法

2、。鯉皰疹病毒Ⅱ型細胞疫苗制備主要以細胞瓶貼壁方式培養(yǎng)病毒，是疫苗規(guī)模化生產的瓶頸因素，探索鯽腦組織細胞（GiCB）與鯉皰疹病毒Ⅱ型規(guī)?；囵B(yǎng)工藝具有潛在的應用前景。本論文針對鯉皰疹病毒Ⅱ型細胞疫苗規(guī)模化制備與應用過程中存在的關鍵工藝問題，開展了鯽腦組織細胞與鯉皰疹病毒Ⅱ型微載體培養(yǎng)技術及其滅活疫苗浸泡免疫效果的研究，旨在為鯽造血器官壞死癥的有效防控提供新的技術途徑。本論文主要研究內容如下：
　　1、研究了在Cephodex微載體懸

3、浮培養(yǎng)系統(tǒng)中規(guī)?；囵B(yǎng)鯽腦組織細胞和鯉皰疹病毒Ⅱ型的工藝。結果表明，Cephodex微載體適合GiCB細胞的貼壁培養(yǎng)，細胞貼壁期培養(yǎng)基中血清濃度為10％，微載體濃度為6g/L；細胞初始接種密度為2.5×105 cells/mL時，以轉速35rpm，每靜置30min攪拌2min的間歇攪拌方式貼壁率最佳，8h后貼壁率可達90%以上；增殖期以45rpm的連續(xù)攪拌速度可獲得最佳的細胞生長效能。采用優(yōu)化的工藝條件，以感染復數(shù)為0.2的CyHV-2

4、病毒接種規(guī)模化培養(yǎng)的GiCB細胞5d后，出現(xiàn)典型的細胞病變效應，病毒滴度（TCID50/mL）可達106.50±0.30。本項研究為鯽造血器官壞死癥疫苗的規(guī)模化制備技術奠定了前期基礎。
　　2、用β-丙內酯（β-propiolactone，BPL）滅活微載體細胞培養(yǎng)的鯉皰疹病毒Ⅱ型制備滅活疫苗，分別用105TCID50/mL和104TCID50/mL的疫苗劑量作為免疫原浸泡免疫健康異育銀鯽魚苗（3.20±0.15cm），部分免疫魚

5、苗在免疫后第4周和第8周后分別進行浸泡感染攻毒實驗，確定不同免疫劑量疫苗的保護效果。同時，另一部分免疫魚苗在首次浸泡4周后同法加強免疫一次，并于二次免疫后第2、4、7、14、21和28天采集魚體樣本，利用實時熒光定量PCR檢測IgM、IL-11和C3補體基因的相對表達量。攻毒感染實驗后取各組的感染死魚進行PCR病毒檢測確定病原并利用TaqMan real-time PCR確定每尾魚體的病毒載量。研究結果顯示，免疫4周后免疫劑量105TC

6、ID50/mL和104TCID50/mL的相對免疫保護率分別為52%和48%，免疫8周后兩種免疫劑量的相對免疫保護率分別為61.6%和53.9%，加強免疫組相對免疫保護率分別為73.1%和65.4%。加強免疫后IgM、IL-11和C3補體基因的相對表達量與對照組相比均上調。攻毒感染實驗后，病死魚PCR病毒檢測均顯示陽性。加強免疫組感染死魚的病毒載量顯著高于其他組（P＜0.01）。由此可見，鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）細胞培養(yǎng)滅活疫苗浸