HBsAg-CT MOMP重疊表位的克隆及鑒定.pdf

1、目的:
　　1.篩選、鑒定沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)主要外膜蛋白(Major OuterMembrane Protein，MOMP)B、CTL細胞表位，選擇富含B表位和CTL表位的肽段為重疊表位疫苗研究提供理論依據(jù)。
　　2.合成酵母密碼子優(yōu)化的乙肝表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)基因，構建PPIC9K/HBsAg△重組質粒(HBs

2、Ag△表示酵母優(yōu)化的HBsAg)，作為呈遞B、CTL細胞重疊表位的載體。
　　3.構建Ct重疊表位的PPIC9K/HBsAg△/Ct MOMP重組質粒，并通過酵母表達系統(tǒng)表達該融合蛋白，為后續(xù)的免疫效應研究奠定基礎。
　　方法:
　　1.以E型Ct標準株MOMP的完整氨基酸序列為基礎，應用在線預測網(wǎng)站SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)，預測MOMP的HLA-A*0201限制性CTL表

3、位，選擇分值較高的肽段，采用肽親和實驗、胞內細胞因子檢測及細胞毒實驗分析預測所得CTL表位。結合本實驗室已經(jīng)報道的B細胞表位[1-2]，綜合分析后選擇同時含B細胞表位及CTL細胞表位的肽段作為重疊表位的候選區(qū)。
　　2.采用酵母密碼子優(yōu)化策略，通過不對稱PCR方法得到HBsAg片段，并克隆至酵母表達載體PPIC9K中，獲得PPIC9K/HBsAg△重組質粒，同時利用PCR從乙肝患者血清中擴出HBsAg（野生型）作為對照。構建的PP

4、IC9K/ HBsAg重組質粒（包括密碼子優(yōu)化和野生型的HBsAg）經(jīng)PCR、酶切和測序分析鑒定。
　　3.將Ct MOMP重疊表位克隆入PPIC9K/HBsAg△重組質粒，構建成嵌合重組質粒PPIC9K/HBsAg△/MOMP重疊表位，并PCR、酶切和測序分析鑒定。目前，正在進行電轉畢赤酵母GS115，經(jīng)G418和組氨酸(His)篩選高拷貝菌株，甲醇誘導重組蛋白的表達，并擬采用SDS-PAGE電泳和Western blot分析鑒

5、定，及通過電鏡觀察HBsAg△/MOMP重疊表位病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLP)的形成。
　　結果:
　　1.CTL表位的預測結合肽親和實驗、胞內細胞因子檢測及細胞毒實驗鑒定結果，MOMP第73～81區(qū)段、第160～169區(qū)段、第217～225和第378～387區(qū)段為抗原特異性、MHC限制性殺傷的CTL表位。結合本實驗室已經(jīng)報道的B細胞表位[1-2]，故選擇第217～225和第378～387區(qū)段

6、作為目的研究片段。
　　2.通過不對稱PCR獲得了HBsAg△片段，成功構建了酵母表達質粒PPIC9K/HBsAg△，并從血清中擴出HBsAg野生型片段，成功構建了PPIC9K/HBsAg（野生型）對照質粒。
　　3.構建了HBsAg△/MOMP嵌合基因，并成功克隆到酵母表達質粒PPIC9K中，構建了兩個含有Ct MOMP重疊表位的酵母表達質粒PPIC9K/HBsAg△/MOMP217-225，PPIC9K/HBsAg△/M

7、OMP378-387。并轉化酵母GS115，重組子鑒定顯示轉化成功。
　　結論:
　　1.經(jīng)預測鑒定篩選了兩個較好的Ct MOMP重疊表位。
　　2.通過分子克隆成功構建了PPIC9K/HBsAg△和PPIC9K/HBsAg（野生型）兩個酵母表達質粒。
　　3.通過分子克隆成功構建了2個含重疊表位的重組質粒PPIC9K/HBsAg△/MOMP217-225和PPIC9K/HBsAg△/MOMP378-387，并轉