UPEC KguS-KguR毒力島的生物學功能研究.pdf

1、尿道感染（urinary tract infection，UTI）是一種常見的細菌感染性疾病，發(fā)病率高，易反復發(fā)作，嚴重危害人類健康，同時也造成巨大的醫(yī)療支出。
　　尿道致病性大腸桿菌（Uropathogenic Escherichia coli，UPEC）是造成尿道感染的最常見病原菌。迄今為止，對UPEC致病性的研究多集中在傳統(tǒng)的毒力因子上，如毒素、粘附素、攝鐵系統(tǒng)等。UPEC在特定的毒力因子（如菌毛、毒素）的作用下侵襲宿主，引

2、起尿道感染。對于UPEC在腎臟生長代謝機制尚未研究清楚。
　　KguS/KguR是在 UPEC中發(fā)現(xiàn)的新型雙組分信號系統(tǒng)，其控制的靶基因c5032、c5034、c5035、c5036、c5037、c5038與c5039被編碼在一個基因島上，該基因島插入在大腸桿菌K12的tyrB和aphA之間。研究結(jié)果表明KguS/KguR雙組分信號系統(tǒng)對 UPEC適應尿道環(huán)境具有重要作用。本論文圍繞 KguS/KguR調(diào)控的基因c5032-503

3、7的功能展開，主要內(nèi)容如下：
　?。ㄒ唬︰PEC的c5032-c5037基因缺失株的構(gòu)建與鑒定。以UPEC的代表菌株CFT073為出發(fā)菌，制備CFT073感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)化法導入質(zhì)粒pKD46，在L-阿拉伯糖的誘導下表達Red重組酶Exo、Bet和Gam，進入CFT073感受態(tài)細胞內(nèi)的氯霉素抗性DNA片段和擬敲除基因發(fā)生重組，在質(zhì)粒pCP20表達的FLP翻轉(zhuǎn)酶重組酶作用下消除氯霉素抗性基因。經(jīng) PCR驗證及測序分析結(jié)果表明，成功構(gòu)

4、建了UPEC的單基因缺失株CFT073△c5032-5035、CFT073△c5036-5037、CFT073△c5032-5037、CFT073△sucAB和 CFT073△sucCD和雙基因缺失株CFT073△c5032-5035/sucAB和CFT073△c5036-5037/sucCD。
　?。ǘ︰PEC的c5032-c5037基因缺失菌生長性能測定。對構(gòu)建的UPEC的單基因缺失株 CFT073△c5032-5035、

5、CFT073△c5036-5037、CFT073△c5032-5037、CFT073△sucAB和 CFT073△sucCD和雙基因缺失株CFT073△c5032-5035/sucAB和 CFT073△c5036-5037/sucCD的生長性能進行測定。結(jié)果表明，在有氧條件下 c5032-5037的基因缺失對 CFT073生長沒有明顯影響，sucAB基因缺失抑制CFT073生長，sucCD和c5036-5037雙基因缺失導致CFT073

6、生長緩慢。
　?。ㄈ︰PEC的c5032-c5037基因功能研究。利用小鼠尿道感染模型進行體內(nèi)競爭實驗，驗證c5032-5037與UPEC在尿道、腎臟的適應性是否相關。將基因缺失株CFT073△c5032-Cm-5037和野生型CFT0731:1混合，尿道接種CBA/J小鼠，進行體內(nèi)感染，48h后剖殺小鼠，無菌取小鼠膀胱和腎臟，勻漿，在普通LB固體培養(yǎng)基平板、含氯霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上分別進行菌落計數(shù)，計算CFT073△

7、c5032-Cm-5037和CFT073的競爭指數(shù)。體內(nèi)競爭實驗結(jié)果表明， CFT073△c5032-Cm-5037與 CFT073在膀胱、腎臟中的競爭指數(shù)分別為0.37、0.29，表明c5032-5037基因缺失大大減弱了CFT073在膀胱和腎臟中的適應能力，證實基因c5032-5037與UPEC在體內(nèi)環(huán)境中的適應性密切相關。
　?。ㄋ模︰PEC的c5032-5037基因編碼蛋白質(zhì)的酶活測定。生物信息學預測，基因c5032、c5

8、034、c5035編碼蛋白質(zhì)與α-酮戊二酸脫氫酶的E1、E2和E3亞基的同源性分別為64％、69%和55%，而基因c5036、c5037編碼蛋白質(zhì)與sucCD編碼的琥珀酰輔酶A合成酶的β亞基和α亞基的同源性分別為70%和83%，因此推測c5032-5037基因編碼蛋白質(zhì)具有類似α-酮戊二酸脫氫酶和琥珀酰輔酶A合成酶的酶學活性。利用PCR擴增c5032-5035和c5036-5037基因片段，經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切，分別與載體pGE

9、N-MCS連接，構(gòu)建重組載體pc5032-5035和pc5036-5037，對重組載體進行PCR驗證、酶切驗證以及測序驗證，然后將驗證正確的重組載體分別轉(zhuǎn)化至CFT073△c5032-5035/sucAB和CFT073△c5036-5037/sucCD基因雙缺失菌株中，構(gòu)建了CFT073△c5032-5035/sucAB（ pc5032-5035）和 CFT073△c5036-5037/sucCD（pc5036-5037）。上述基因回補

10、菌接種LB液體培養(yǎng)基，高速離心，收集菌體沉淀，超聲波破碎，高速離心后取上清液進行 SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)果表明重組載體成功表達了目的蛋白。對表達蛋白進行α-酮戊二酸脫氫酶和琥珀酰輔酶A合成酶的酶活測定，結(jié)果證實c5032-5035編碼蛋白質(zhì)具有α-酮戊二酸脫氫酶活性，c5036-5037編碼蛋白質(zhì)具有琥珀酰輔酶A合成酶活性，為闡明UPEC在體內(nèi)的適應性致病機制奠定了基礎。
　　本論文初步證實c5032-c5037基因與UPE