人Tenascin-R蛋白EGFL片段抗血清治療中樞神經(jīng)損傷的體外研究.pdf

1、研究背景:
　　 顱腦創(chuàng)傷(Traumatic Brain Injury, TBI)死、殘率高，在全身創(chuàng)傷中高居第一位，其原因是大腦生命中樞神經(jīng)組織嚴(yán)重受損，神經(jīng)功能障礙所致，要解決神經(jīng)功能重建就必須攻克神經(jīng)再生這一重大基礎(chǔ)性課題。
　　 成功的神經(jīng)再生可分位以下三個(gè)階段:
　　 (1)受損神經(jīng)元及其支持細(xì)胞的存活;
　　 (2)由存活神經(jīng)元再生的軸突生長(zhǎng)跨過損傷區(qū);
　　 (3)新建立的神經(jīng)環(huán)路

2、成功補(bǔ)償神經(jīng)系統(tǒng)損傷區(qū)的功能缺失。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，神經(jīng)再生僅存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system)和處于發(fā)育期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervoussystem，CNS），而成熟后的中樞神經(jīng)不可再生。然而Aguayo等在將外周神經(jīng)組織移植到中樞神經(jīng)損傷部位后發(fā)現(xiàn)，軸突延伸到移植物中。但當(dāng)再生的軸突在移植物遠(yuǎn)側(cè)界面遇到宿主組織細(xì)胞時(shí)候，就出現(xiàn)了生長(zhǎng)抑制。這項(xiàng)研究推翻了傳統(tǒng)的觀念并形成新的概念:中樞神

3、經(jīng)軸突并非缺乏再生能力，而是中樞內(nèi)環(huán)境不適合再生。目前形成的共識(shí)是內(nèi)環(huán)境的不同主要是由于它們所擁有的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的類型不同造成，周圍神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞為雪旺細(xì)胞，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)則為少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞三種。
　　 最新的研究表明，CNS損傷后會(huì)啟動(dòng)一系列與形成瘢痕組織相關(guān)的細(xì)胞及分子間的反應(yīng)，最終形成以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主的瘢痕組織，環(huán)繞著充滿組織液的囊泡。膠質(zhì)瘢痕對(duì)軸突再生的影響除了空間阻礙等物理因素外，由形成瘢

4、痕的細(xì)胞所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在損傷區(qū)的堆積也是抑制軸突再生的重要因素。目前已知，硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulphate proteoglycans，CSPGs)和腱糖蛋白-R(Tenascin-R，TN-R)即為瘢痕組織中所含有的最重要的兩種有軸突生長(zhǎng)抑制作用的成分，以上因素再加上損傷區(qū)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的缺如、免疫反應(yīng)、內(nèi)分泌激素的刺激以及自由基的損害加速了CNS神經(jīng)元

5、的損傷，最終阻礙了CNS的再生。
　　 有研究發(fā)現(xiàn)，使用軟骨素酶ABC可以消化分解損傷區(qū)堆積的CSPGs，從而能促進(jìn)損傷后的軸突再生，而單獨(dú)針對(duì)TN-R的處理措施則未見有報(bào)道。但有人利用TN-R基因敲除鼠研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，基因敲除鼠的運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)情況好于野生型鼠;也有人通過面神經(jīng)損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，TN-R基因敲除的小鼠在面神經(jīng)損傷一定時(shí)間后，觸須抖動(dòng)的次數(shù)明顯多于野生型小鼠。以上研究均說(shuō)明，針對(duì)TN-R進(jìn)行處理亦有可能促進(jìn)中

6、樞神經(jīng)損傷后的軸突再生。但鼠TN-R基因敲除后出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的減退，更容易被激怒，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力下降等副作用，說(shuō)明要想將TN-R作為藥物靶點(diǎn)來(lái)促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后再生必須使用針對(duì)其特定結(jié)構(gòu)域的方法以避免上述不良反應(yīng)，且最好是局部給藥。
　　 TN-R蛋白是一個(gè)大的多域蛋白，其由富含半胱氨酸N末端序列，4.5個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣(EGFL)的重復(fù)序列，8個(gè)纖維連接蛋白Ⅲ樣序列(FN)和C末端構(gòu)成，與纖維蛋白素原鈣連接序列具有同源性

7、，基因序列分析其結(jié)構(gòu)高度保守，人和大鼠的同源性為93％。目前研究發(fā)現(xiàn)，TN-R分子上具有神經(jīng)元胞體和生長(zhǎng)錐排斥活性的主要為EGF及FN3-5結(jié)構(gòu)域。因此，本研究使用原核方法構(gòu)建了人TN-R蛋白的EGFL片段，并制備了兔來(lái)源的相應(yīng)抗血清，于體外利用該抗血清與TN-R蛋白以不同組合包被多孔板形成不同的培養(yǎng)基質(zhì)，研究其對(duì)于大鼠皮層神經(jīng)元的影響。雖然單克隆抗體有更高的特異性，但其技術(shù)要求高，成本相對(duì)高昂。而本研究主要是初步觀察中和靶片段能否對(duì)神

8、經(jīng)元產(chǎn)生影響，故先行使用經(jīng)典的、容易獲得的含高濃度多克隆抗體的抗血清。
　　 第一部分人TN-R蛋白EGFL片段(aa199-323)的原核表達(dá)及其抗血清的制備
　　 目的:
　　 制備高濃度兔來(lái)源的EGFL(aa199-323)片段抗血清并進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究其體外功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 將含TN-R蛋白氨基酸編碼序列基因的質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物PCR得到目的片段，在c端加上6×His的堿

9、基，連接入PGEX-4T-1載體，構(gòu)成融和蛋白，測(cè)序證實(shí)基因序列與預(yù)期一致。將PGEX-4T-1-TN-R aa199-323轉(zhuǎn)化入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落PCR陽(yáng)性的單菌落接種子卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD為0.6～0.8時(shí)分別加入不同終濃度的IPTG誘導(dǎo)，在不同時(shí)間點(diǎn)分別收集樣本行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色顯示蛋白條帶，分析確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，取最高蛋白表達(dá)量的菌液適量離心，沉淀重懸于裂菌緩沖液，冰浴

10、超聲裂解，分別取上清、沉淀行SDS-PAGE電泳及Western blot檢測(cè)，以明確目的蛋白在宿主菌中的表達(dá)形式并驗(yàn)證融合蛋白是否正確表達(dá)。優(yōu)化表達(dá)條件下，大量培養(yǎng)1000mL菌液，離心后收集菌體沉淀，裂解緩沖液重懸細(xì)菌，冰浴后超聲破碎，離心獲取包涵體，脲溶解后經(jīng)Ni-NTA螯合樹脂層洗脫回收目的蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳結(jié)果經(jīng)Bandscan5.0圖像分析軟件計(jì)算蛋白純度。為了獲得純度更高的蛋白，將全部蛋白初樣

11、經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，切取目的蛋白膠塊-80℃凍存。凍存過夜的蛋白膠塊加適量弗氏佐劑研磨，從分乳化后，新西蘭大白兔背部多點(diǎn)皮下注射。每隔7天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，第三次免疫注射后的第10天經(jīng)靜脈少量采血，離心獲得血清，以免疫前兔血清作為陰性對(duì)照，ELISA測(cè)定血清效價(jià)，確定效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平后即經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈放血，照靜脈取血后的方法收獲抗血清，分裝成10μl后-80℃凍存。表達(dá)PGEX-4T-1-TN-Raa199-323融合蛋白的Ros

12、etta菌體總蛋白及提取的大鼠腦組織膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，制備的TN-R蛋白EGFL抗血清為一抗，Western blot法驗(yàn)證抗體的特異性。用純化后PGEX-4T-1-TN-R aa199-323融合蛋白包被ELISA反應(yīng)孔，以免疫前兔血清作為陰性對(duì)照，ELISA法檢測(cè)該抗血清的效價(jià)。
　　 結(jié)果:
　　 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后PCR陽(yáng)性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，收集細(xì)菌蛋白。SDS-PAGE電泳顯示，在37℃、1mM I

13、PTG誘導(dǎo)4h的條件下，融合蛋白高表達(dá)，經(jīng)抗His標(biāo)簽的單克隆抗體行Western blot鑒定證實(shí)該蛋白條帶為PGEX-4T-1-TN-Raa199-323融合蛋白;菌體沉淀經(jīng)超聲破碎后，上清及沉淀的SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)一步證明，該重組蛋白主要以包涵體形式存在。再按該優(yōu)化表達(dá)條件擴(kuò)大培養(yǎng)體系，收獲包涵體蛋白，純化后回收重組融合蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度為0.65mg/L。將獲得的蛋白免疫成年健康新西蘭大白兔后，家兔健康狀況良好，

14、未出現(xiàn)死亡及其他異常反應(yīng)。第3次免疫注射后的10d經(jīng)耳緣靜脈取血，ELISA測(cè)定血清效價(jià)均高于1:512000，達(dá)到預(yù)期效價(jià)，即改用頸動(dòng)脈采血法收獲血液共32ml，制備抗血清10ml，收獲的對(duì)照血清及抗血清均經(jīng)過0.18μm濾膜濾過除菌，分裝后于-80℃凍存。
　　 結(jié)論:
　　 人TN-R蛋白EGFL片段可經(jīng)原核表達(dá)，所獲得的蛋白片段免疫新西蘭大白兔后可制備高效價(jià)及較高特異性的抗血清。為進(jìn)一步研究其體外功能奠定了基礎(chǔ)。

15、
　　 第二部分 SD大鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:
　　 改進(jìn)現(xiàn)有的皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)技術(shù)，獲得穩(wěn)定的、操作簡(jiǎn)便、生長(zhǎng)狀態(tài)好的培養(yǎng)方法，并對(duì)該方法培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。
　　 方法:
　　 使用單細(xì)胞懸液法及小組織塊法分別培養(yǎng)，兩種培養(yǎng)方法分別如下所述:單細(xì)胞懸液法為在無(wú)菌條件下取出出后2～3d的SD大鼠大腦，于顯微鏡下去除腦膜、血管后使用彎顯微剪刀剪取皮層灰質(zhì)，將皮層粗剪成3～5

16、mm3或更小碎塊，用0.05％胰酶及10ug/ml DNAse(Ⅰ)37℃下消化8～10min,用胎牛血清終止消化，通過200目篩網(wǎng)后1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘棄上清，使用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌兩次，使用含10％FBS的DMEM/F12重懸，以1～3×105/cm2密度（按實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌褂貌煌募?xì)胞密度）接種于預(yù)先包被好培養(yǎng)基質(zhì)的多孔板中，再加入青霉素和鏈霉素，4～6小時(shí)后全部更換為含2％B27的Neurobasal-A無(wú)血清培養(yǎng)基

17、中，并加入L-谷氨酸，以后每3～5天半量換液一次。小組織塊法則在將皮層剪成3～5mm3碎塊后，用無(wú)菌注射器管芯擠壓濾過50目不銹鋼濾網(wǎng)，收集濾液，800轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，棄上清，使用DMEM/F12培養(yǎng)基漂洗下層組織塊，再使用20ul微量加樣槍吸取300～500um直徑的小組織塊于顯微鏡下接種入預(yù)先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基質(zhì)的多孔板中，30～60分鐘待組織塊貼壁后每孔加入200ul含2％B27的Neurobasal-A無(wú)血清培養(yǎng)基，20小時(shí)后再每孔

18、輕柔的加入300ul該培養(yǎng)基，并加入L-谷氨酸，以后每3～5天半量換液一次。兩種培養(yǎng)方法培養(yǎng)第7天后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，選取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞使用4％多聚甲醛固定，β-Ⅲ-tubulin(—)抗使用間接法免疫熒光染色，熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。
　　 結(jié)果:
　　 單細(xì)胞懸液法培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，每只新生大鼠可獲得2～16×106個(gè)細(xì)胞，熒光顯微鏡下顯示多數(shù)細(xì)胞為染色陽(yáng)性細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下可

19、見染色陽(yáng)性細(xì)胞突起生長(zhǎng)狀況良好，相互之間連接緊密，呈現(xiàn)典型的網(wǎng)格狀;小組織塊法大部分組織塊可以貼壁并從中遷徙出細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞透明，呈向心性生長(zhǎng)，細(xì)胞周邊光暈明顯，有較多突起生長(zhǎng)，并形成稀疏網(wǎng)絡(luò)。
　　 結(jié)論:
　　 使用改進(jìn)的大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法可獲得大量的較高純度神經(jīng)元，神經(jīng)元貼壁良好，突起生長(zhǎng)良好，小組織塊法組織塊大部貼壁并遷徙出細(xì)胞，均可應(yīng)用于下階段研究。
　　 第三部分人Tenasc

20、in-R蛋白EGFL片段抗血清對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元的影響
　　 目的:
　　 研究人Tenascin-R(TN-R)蛋白的EGFL功能片段及該片段抗血清，聯(lián)合Tenascin-R蛋白研究其在體外對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元的作用影響，探討該功能片段抗血清用于治療中樞神經(jīng)損傷后再生的可行性。
　　 方法:
　　 將實(shí)驗(yàn)第一部分制備的多克隆抗血清聯(lián)合TN-R蛋白包被多孔板形成不同的鋪板狀態(tài)，據(jù)不同的鋪板狀態(tài)進(jìn)行分組，再照實(shí)驗(yàn)

21、第二部分的細(xì)胞培養(yǎng)方法按不同的分組接種入多孔板中，培養(yǎng)一定時(shí)候后于倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察在不同條件下不同鋪板狀態(tài)對(duì)于大鼠皮層神經(jīng)元黏附、遷徙及突起生長(zhǎng)的影響，獲得的數(shù)據(jù)使用數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 實(shí)驗(yàn)第一部分制備的抗血清在體外條件下單獨(dú)存在時(shí)對(duì)神經(jīng)元