重組小鼠糖調(diào)節(jié)蛋白78的構(gòu)建、純化及對DC生成影響的初步研究.pdf

1、背景與目的：
　　葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶,是熱休克蛋白70家族的成員之一,GRP78參與未折疊蛋白反應(yīng)(UPR),在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了十分重要的作用。近年來有研究報道,GRP78可以影響樹突狀細(xì)胞(DC)的發(fā)育,DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(APC),在免疫應(yīng)答及啟動抗腫瘤免疫反應(yīng)中均起著關(guān)鍵作用。課題組前期工作證明,增加糖調(diào)節(jié)蛋白78(Grp78)在胰島β細(xì)胞的表達(dá)不僅可以

2、保護(hù)胰島β細(xì)胞抵抗凋亡,同時還可誘導(dǎo)免疫負(fù)調(diào) T細(xì)胞的形成,參與免疫調(diào)節(jié),但其機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了鼠源性GRP78原核表達(dá)載體,并進(jìn)行了表達(dá)與純化,進(jìn)一步將純化蛋白加入小鼠骨髓來源的DC誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測GRP78對DC分化的影響,為進(jìn)一步研究GRP78在細(xì)胞凋亡以及免疫調(diào)節(jié)中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.PGEX-4T-3-GRP78表達(dá)載體的構(gòu)建
　　以鼠源GRP78的載體pIRES

3、2-EGFP-GRP78為模板,設(shè)計與GRP78互補(bǔ)的引物,引入酶切位點(diǎn),采用PCR擴(kuò)增GRP78基因,將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接,對含有目的基因的pGEM-T-GRP78質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定,將測序正確的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增,酶切 GRP78目的基因片段,亞克隆至 pGEX-4T-3,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒酶切電泳鑒定。
　　2.GRP78蛋白的表達(dá)與純化
　　將成功構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL2

4、1,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物通過12％SDS-PAGE鑒定,根據(jù)鑒定結(jié)果選擇最適IPTG誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時間,誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物采用Western-blot鑒定。提取可溶性蛋白,采用GST純化試劑盒純化蛋白,收集純化產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)12％SDS-PAGE及Western-blot分析鑒定。
　　3.小鼠骨髓來源DC的制備及培養(yǎng)與表面標(biāo)志的檢測
　　從Balb/c小鼠中分離骨髓來源的單個核細(xì)胞,加入約16ml完全培養(yǎng)基(1640+10

5、％胎牛血清),輕輕吹打混勻,轉(zhuǎn)入24孔板中,2ml/孔,并分別加“雙抗”(青霉素/鏈霉素),終濃度為100U/ml,GM-CSF終濃度10ng/ml,37℃,5％CO2溫箱;設(shè)立不同實(shí)驗(yàn)組,包括:①對照組;②LPS刺激組;③未處理組;④加入純化的rmGRP78蛋白;⑤-⑧不同時間加入純化的rmGRP78蛋白+LPS組。于第3日、第5日半量換液,第7日棄上清加約1ml培養(yǎng)基。12h后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：

6、
　　1.測序正確的pGEM-T-GRP78質(zhì)粒酶切GRP78目的基因片段,與相應(yīng)酶切的表達(dá)載體pGEX-4T-3連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒酶切電泳鑒定。酶切鑒定符合鼠源GRP78理論值,DNA序列分析結(jié)果顯示與Gene Bank中的GRP78序列一致,蛋白序列完全相符,結(jié)果表明鼠源GRP78克隆以及原核表達(dá)載體pGEX-4T-3-GRP78構(gòu)建成功。
　　2.表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)

7、表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物采用BCA法測定其蛋白濃度約為2mg/mL,SDS-PAGE電泳鑒定在78KD處可見明顯蛋白條帶,與GRP78的理論值相符,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后的純度可達(dá)到90％以上。Western blot鑒定結(jié)果顯示,純化蛋白可與抗GRP78抗體特異性結(jié)合,結(jié)果提示成功獲得純化的表達(dá)產(chǎn)物。
　　3.將rmGRP78與骨髓來源的單個核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)后,CD11c+細(xì)胞比例明顯少于對照組。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了PGEX