胸膜肺炎放線桿菌血清1型ApxIA N-端多肽免疫原性的確定及表達(dá)該多肽的血清7型重組菌株的構(gòu)建.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（APP）引起的一種豬傳染性呼吸道疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防和控制該病的主要措施是疫苗免疫接種。 目前商品化的全菌滅活疫苗和亞單位疫苗能夠減輕同源血清型菌感染豬引起的臨床癥狀并降低死亡率，但不能降低發(fā)病率、慢性感染和阻止肺部病變，對異源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保護(hù)?？梢哉f，目前采用滅活苗和亞單位疫苗免疫不是最好的選擇，迫切需要更安全、高效的新型疫苗來預(yù)防和

2、控制該傳染病的發(fā)生與流行。 與滅活疫苗和亞單位疫苗不同，自然感染或試驗感染能夠誘導(dǎo)抗任何異源血清型的保護(hù)。這樣，弱毒活疫苗也許是解決當(dāng)前商品化疫苗不足的一種可行方法。構(gòu)建胸膜肺炎放線桿菌突變株的傳統(tǒng)方法存在很多缺陷。利用化學(xué)或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的突變方法存在隨機性，只適合于表型發(fā)生明顯變化的突變子篩選，而不導(dǎo)致明顯表型變化的突變株就不能夠通過這些方法獲得；而通過同源重組導(dǎo)致靶基因突變方法獲得的突變株最后含有抗性標(biāo)記，由于不符合生物安全性

3、要求不能作為疫苗株用于疫苗生產(chǎn)。本實驗室貝為成博士缺失了ApxⅡ的毒力激活因子ApxⅡC的編碼基因apxⅡC，獲得了基因工程毒力缺失突變株HBC<'->／GFP<'+>，其毒力顯著減弱，并能誘導(dǎo)試驗動物產(chǎn)生免疫保護(hù)，對同血清7型APP的攻擊保護(hù)率為100％，但對異源血清1型的攻擊保護(hù)率只有75％。為了進(jìn)一步提高HBC<'->／GFP<'+>突變株的免疫效力，設(shè)想以該基因缺失菌株為載體表達(dá)ApxⅠ的結(jié)構(gòu)基因apxⅠA，構(gòu)建新的重組菌株。然

4、而，apxⅠA全長3000多個堿基，采用同源重組的方法引入全長apxⅠA非常困難。鑒于上述背景，本研究確定了ApxⅠ毒素的主要免疫原性區(qū)段，試圖通過使用同源重組技術(shù)和負(fù)向選擇方法構(gòu)建不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌毒素apxⅡC<'->／apxⅠA5<'+>基因工程突變株，主要研究內(nèi)容包括： 1．ApxⅠ外毒素N端多肽的免疫原性研究 ApxⅠ外毒素是豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）最重要的毒力因子，為了研究其N端多肽的免疫原

5、性，分別將apxⅠA基因的全長編碼區(qū)（apxⅠA，3146bp）及其5’端1140bp的片段（apxⅠA5）克隆到原核表達(dá)載體pET-28a，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌中實現(xiàn)了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物ApxⅠA和ApxⅠAN均以包涵體的形式存在，Western-blot檢測證實兩種表達(dá)產(chǎn)物均具有免疫反應(yīng)性。將純化的重組蛋白（rApxⅠA和rApxⅠAN）和提取的天然毒素ApxI（nApxI）分別經(jīng)腹腔免疫BALB／c小鼠，于免疫前、免疫2周和4周

6、后分別檢測了ELISA抗體和毒素中和抗體水平，結(jié)果表明，rApxⅠAN免疫組的ELISA抗體顯著低于rApxⅠA免疫組和nApxⅠ免疫組，但rApxⅠAN免疫組血清中和試驗中測定的溶血素單位與rApxⅠA及天然nApxⅠ免疫組沒有顯著差異。第二次免疫2周后，用1個LD50的APP血清1型J101株和2型標(biāo)準(zhǔn)菌株攻擊試驗動物，rApxIAN免疫組對血清1型和2型菌株的保護(hù)率分別為80％和100％。 2．表達(dá)ApxIA的重組胸膜肺

7、炎放線桿菌血清7型候選疫苗菌株的研究 通過PCR克隆了胸膜肺炎放線桿菌（APP）血清7型HB株的apxIIXCA操縱子基因，并克隆到pBluescript SK（+）載體中得到重組質(zhì)粒pSKPP。對其中的apxIIC基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明克隆的apxIIC基因具有RTX毒素脂?；D(zhuǎn)移酶家族的所有特性。通過酶切缺失pSKPP質(zhì)粒中apxIIC基因編碼區(qū)的180bp的片斷，獲得質(zhì)粒pSKPP△C。將來源于APP血清1型的編碼

8、ApxIA氨基端抗原結(jié)構(gòu)域的1140bp基因片斷（apxIA5）克隆到pSKPP△C的缺失位點，使其與ApxIIC氨基端的60個氨基酸編碼序列融合，獲得重組質(zhì)粒pSNSKPP。同時，在質(zhì)粒pSKPP中的apxIICA操縱子的啟動子與apxIIC基因的起始密碼子之間引入一個BamHI酶切位點，再用apxIA5置換該質(zhì)粒中的apxIIC基因的5’端編碼區(qū)，獲得利用自身起始密碼子表達(dá)的ApxIA氨基端380個氨基酸的重組質(zhì)粒pBNSKPP。最