鮑曼不動桿菌院內(nèi)感染及耐藥性傳播機制研究.pdf

1、目的:以浙江省七家地區(qū)代表性醫(yī)院臨床分離的院內(nèi)感染鮑曼不動桿菌為研究對象，了解鮑曼不動桿菌院內(nèi)感染現(xiàn)狀及耐藥性分布特征，找出主要的流行克隆株并研究其耐藥性傳播機制。
　　 方法1.細菌培養(yǎng):將保存合格的398株臨床分離株自-80℃超低溫冰箱中取出，置于室溫融化復蘇后，在生物安全柜操作臺上采用三區(qū)劃線法接種于羊血瓊脂平板，放入35℃恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜。
　　 2.細菌鑒定:從羊血瓊脂平板上挑取單個菌落，VITEK-32型全

2、自動微生物分析儀自動鑒定。
　　 3.細菌鑒定復核:由VITEK-32型全自動微生物分析儀鑒定的鮑曼不動菌，經(jīng)PCR擴增16S rDNA測序復核確定菌種為鮑曼不動桿菌。
　　 4.抗菌藥物敏感性試驗:采用瓊脂稀釋法測定398株院內(nèi)感染鮑曼不動桿菌對15種抗菌藥物的MIC值，結果判定為敏感、中介、耐藥。判定標準參照2010年美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準。
　　 5.脈沖場凝膠電泳(PFGE):參照病原菌

3、分子分型實驗室監(jiān)測國際網(wǎng)絡PluseNet公布的鮑曼不動桿菌的標準化PFGE分子分型方案。鮑曼不動桿菌菌株用ApaI酶切，標準菌株H9812用XbaI酶切。采用PFGE398株鮑曼不動桿菌進行分子分型。
　　 6.多位點序列分型(MLST):根據(jù)PFGE結果從各地區(qū)挑選主要流行克隆株，進行MLST試驗。應用eBURST程序將STs歸為譜系(clonal complex)，采用UPGMA方法構建系統(tǒng)進化樹，采用SplitsTree

4、軟件構建ST型親緣關系樹。
　　 7.生物膜形成試驗:采用96孔板結晶紫染色法檢測鮑曼不動桿菌在LB培養(yǎng)基中生物膜的形成能力。參照Stepanovic等的評估方法，將菌株生物膜形成能力分為四類，運用SPSS11.0分別對細菌的耐藥率與生物膜形成能力進行相關性分析。
　　 8.質粒接合轉移試驗:選取每個地區(qū)的主要流行克隆株進行質粒接合轉移試驗，對接合子進行質粒提取鑒定、藥敏試驗研究。
　　 結果:1.院內(nèi)感染鮑曼不

5、動桿菌病例以老年患者（年齡＞60歲）、呼吸道感染患者及ICU患者居多，分別占38.94％，73.37％和40.95％。
　　 2.398例鮑曼不動桿菌對15種常用抗菌藥物耐藥率超過50％的抗菌藥物有11種，占總體的73.33％;對氨芐西林耐藥率最高，為95.48％;對β-內(nèi)酰胺類抗生素普遍耐藥，對第三代頭孢菌素（頭孢噻肟，頭孢曲松和頭孢他啶）的總耐藥率為74.04％，對第四代頭孢菌素頭孢吡肟的耐藥率為57.54％;對頭孢哌酮/舒

6、巴坦及碳青霉烯類抗生素耐藥率分別為23.62％和29.15％。
　　 3.PFGE結果顯示398株鮑曼不動桿菌分為31個PFGE型5個主要流行克隆群，A群，236株，占試驗菌株數(shù)的59.3％，在除寧波、嘉興外的5個地區(qū)均有分布，且均為該地區(qū)鮑曼不動桿菌的主要流行克隆株。B群，30株，占試驗菌株數(shù)的7.5％，其中20株分離自麗水，10株分離自溫州和紹興。C群，21株，占試驗菌株數(shù)的5.3％，其中19株分離自寧波，3株分離自杭州。D

7、群，19株，占試驗菌株數(shù)的4.8％，分離自紹興和杭州。E群，13株，占試驗菌株數(shù)的3.3％，分離自杭州、寧波、嘉興和溫州。
　　 4.根據(jù)PFGE結果從各地區(qū)挑選其主要流行克隆株，共計45株進行MLST試驗，結果顯示所選菌株屬于14個ST型，其中9個為新發(fā)現(xiàn)的ST型，本研究中以ST1000～ST1008表示。
　　 5.定量測定242株多重耐藥鮑曼不動桿菌生物膜形成情況，其中17株為（-），71株為(+)，71為(++)

8、，83株為（+++），92.97％的菌株具有生物膜形成能力，其中63.63％具有中等或強的生物膜形成能力，并且隨生物膜形成能力增強，對復方新諾明、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、哌拉西林、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、阿米卡星、氯霉素的耐藥性升高(P＜0.05)。
　　 6.選取每個地區(qū)的主要流行克隆株（41株多重耐藥鮑曼不動桿菌）為供體菌進行質粒接合轉移試驗，其中14株多重耐藥鮑曼不動桿菌與受體菌（利福平耐藥的大腸埃希菌