吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑抗人肺癌裸鼠移植瘤的作用機制的研究.pdf

1、目的:每年全世界約有120萬患者被確診為肺癌，而且肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，其預(yù)后很差，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較早、臨床較常見。由于肺癌早期癥狀隱秘，多數(shù)患者被確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移。侵襲和轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者預(yù)后的重要原因之一，探究淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞因子及探尋抑制淋巴轉(zhuǎn)移的藥物是遏制肺癌發(fā)展及改善患者預(yù)后的重要方法。
　　 隨著分子生物學(xué)不斷的發(fā)展，人們對肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移機制及其特異因子表達的研究亦在不斷深入。
　　 EGFR

2、(epidermalgrowthfactorreceptor)表皮生長因子受體是ErbB受體家族的重要成員，其在多種腫瘤組織呈過度表達，尤其在已發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤中表達上調(diào)。朱叢中[1]等應(yīng)用組織芯片技術(shù)與免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)EGFR與環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)在肺癌組織中的表達呈正相關(guān)，二者均與肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，COX-2和EGFR的激活與調(diào)節(jié)均與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activ

3、atedproteinkinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)等信號通路相關(guān)，兩者之間存在直接或間接的相互活化關(guān)系。
　　 C-erbB-2(HER-2、Neu)作為表皮細(xì)胞生長因子家族中的重要成員之一，是原癌基因的編碼產(chǎn)物。HE-2大多通過癌基因的擴增和過表達激活，進一步通過一定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移、黏附、存活、凋亡，加快細(xì)胞增殖

4、、加速細(xì)胞周期來增強惡化，同時會抑制惡性細(xì)胞凋亡并對多數(shù)化療藥產(chǎn)生耐藥。
　　 趨化因子受體4(CXCR4)屬CXC受體亞家族，是趨化性細(xì)胞因子CXCL12即基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)的專屬受體。在其趨化因子特異性受體介導(dǎo)作用下，構(gòu)成CXC-L12/CXCR4生物軸，形成一個與細(xì)胞間信息傳遞、細(xì)胞遷移等有密切關(guān)系的偶聯(lián)分子對。近年研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4軸在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用[2-3]

5、>　　 β-連環(huán)素(β-catenin)是上皮鈣黏素-連環(huán)素復(fù)合體(E-cadherin/catenin)和Wnt信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，β-連環(huán)素的異常蓄積，引起細(xì)胞增殖或腫瘤發(fā)生，與肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 吲哚美辛(Indomethacin，In)為非甾體類抗炎藥(NSAIDs)之一，其對肺癌移植瘤的抑制作用及其機制國內(nèi)外文獻報道不多，但近年聯(lián)合應(yīng)用COX-2抑制劑是否可增強化療藥物的細(xì)胞毒性作用和抗淋巴生成效應(yīng)的

6、研究逐漸增加。奧沙利鉑(oxaliplatin)是第三代鉑類廣譜抗癌藥，通過產(chǎn)生烷化結(jié)合物作用于DNA，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA的合成及復(fù)制。本實驗旨在研究吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑抗人肺癌裸鼠移植瘤的作用及EGFR、β-catenin、C-erbB-2、CXCR4表達的影響，以探討肺癌侵襲轉(zhuǎn)移機制，為治療肺癌尋求新的靶點。
　　 方法:
　　 選25只4～5周齡BALB/c雄性裸小鼠，體重20～24克，在IVC無菌

7、飼料及滅菌純凈水飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境無特定病原體，環(huán)境溫度、濕度適宜。使用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的F12k培養(yǎng)基，在37℃含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁生長到70％～80％融合時，用0.25％胰蛋白酶進行消化并傳代。將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，先用PBS洗滌后，再用0.25％胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，收集于離心管，以離心機1000rpm平衡離心5分鐘，棄去上清液。用F12k（不含血清）培養(yǎng)

8、基稀釋，用血細(xì)胞計數(shù)板對A549細(xì)胞進行計數(shù)，細(xì)胞計數(shù)完畢，密度為1×107/ml。裸鼠皮膚消毒后，以1ml注射器分別在每只裸鼠左腋部皮下接種已制成的細(xì)胞懸液0.2ml。建立肺癌裸鼠移植瘤模型。其中25只裸鼠成瘤，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積的長徑(a)、短徑(b)，按照公式V=ab2/2，估算腫瘤近似體積。待移植瘤平均直徑約4mm后，去掉腫瘤體積最小的裸鼠，將剩余裸鼠隨機分為對照組、吲哚美辛組(2.5mg/kg/d)、奧沙利鉑組、奧沙利鉑和

9、吲哚美辛聯(lián)合用藥組，每組6只。奧沙利鉑甘露醇注射液采用腹腔注射給藥，劑量為10mg/kg/次，每周給藥2次;吲哚美辛組采用灌胃給藥，劑量為2.5mg/kg，每天給藥1次。對照組腹腔注射等量生理鹽水，口服滅菌蒸餾水。給藥42天后，斷頸處死裸鼠，取腫瘤組織，免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中EGFR、C-erbB-2、CXCR4、β-catenin蛋白的表達，以北航真彩色病理圖像分析系統(tǒng)計算平均積分光密度值。熒光實時定量PCR法檢測腫瘤組織中EG

10、FR、C-erbB-2、CXCR4、β-cateninmRNA的表達。
　　 結(jié)果:
　　 25只裸鼠接種肺癌A549細(xì)胞，全部成瘤，肺癌細(xì)接種后第10天，腫瘤結(jié)節(jié)直徑平均約4mm。
　　 以圖像分析系統(tǒng)對EGFR、C-erbB-2、CXCR4、β-catenin蛋白免疫組織化學(xué)染色切片進行平均積分光密度測定，單因素方差分析得出結(jié)果，吲哚美辛組及聯(lián)合組EGFR、β-catenin、C-erbB-2、CXCR4蛋白

11、表達水平均較對照組明顯降低(分別P＜0.05)，且聯(lián)合組表達低于吲哚美辛組(分別P＜0.05);與對照組相比，奧沙利鉑組EGFR、C-erbB-2、CXCR4、β-catenin表達水平無明顯區(qū)別(P＞0.05)。
　　 實時熒光定量PCR法測定EGFR、C-erbB-2、CXCR4、β-cateninmRNA，單因素方差分析得出結(jié)果，吲哚美辛組及聯(lián)合組EGFR、C-erbB-2、CXCR4、β-cateninmRNA表達水平均

12、較對照組明顯降低(分別P＜0.05)，同時聯(lián)合組表達低于吲哚美辛組(P＜0.05);與對照組相比，奧沙利鉑組EGFR、C-erbB-2、CXCR4、β-catenin表達水平無明顯區(qū)別(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1吲哚美辛能使肺癌裸鼠移植瘤EGFR、C-erbB-2、CXCR4、β-catenin蛋白，及EGFR、C-erbB-2、CXCR4、β-cateninmRNA的表達顯著減少。說明吲哚美辛能通過基因和