吲哚美辛抗人肺癌裸鼠移植瘤淋巴轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制及其化療輔助作用的研究.pdf

1、目的：肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率高居全球惡性腫瘤的首位，五年生存率僅10～15％，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。在國內(nèi)，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占80％以上，其中主要是腺癌(23.0％～38.5％)和鱗癌(39.4％～53.9％)。肺癌早期癥狀不典型，臨床確診時多已發(fā)生轉(zhuǎn)移并發(fā)展到晚期。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，尋找能抑制淋巴轉(zhuǎn)移的藥物是惡性腫瘤化療的新途徑。
　　 近年來人們對肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移機(jī)制及其特異

2、因子表達(dá)的研究在不斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)肺癌中環(huán)氧化酶-2(COX-2)呈過度表達(dá)，尤其在腺癌中的表達(dá)明顯上調(diào)，其不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，也促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)及其受體3(VEGFR-3)是調(diào)控淋巴管生成最重要的信號通路。腫瘤組織中VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)上調(diào)，可促使其中的淋巴管密度增加，并促進(jìn)淋巴管浸潤和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究證實(shí)，COX-2參與調(diào)節(jié)了V

3、EGF-A/VEGFR-1，2血管形成通路，且COX-2抑制劑可抑制肺癌微血管的生成。近來研究表明VEGF家族成員及其受體之間相互二聚化，并形成網(wǎng)絡(luò)化機(jī)制，VEGF-A與VEGF-C在腫瘤細(xì)胞分泌后形成異源二聚體，通過協(xié)同作用導(dǎo)致血管與淋巴管生成，由此可間接促進(jìn)淋巴管增生導(dǎo)致淋巴轉(zhuǎn)移增加。
　　 β-連環(huán)素(β-catenin)作為胞漿內(nèi)的一種重要多功能蛋白，具有介導(dǎo)細(xì)胞粘附和在Wnt信號傳導(dǎo)途徑中起重要作用的雙重功能。研究發(fā)現(xiàn)

4、β-catenin異常表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的提高，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。反應(yīng)細(xì)胞凋亡的生存素(Survivin)是Wnt通路的重要下游基因，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。體外實(shí)驗(yàn)示非甾體抗炎藥可通過抑制Wnt通路的來降低Survivin的表達(dá)。
　　 吲哚美辛(Indomethacin，In)作為非甾體抗炎藥，其對肺癌移植瘤的抑制作用及其機(jī)制國內(nèi)外文獻(xiàn)報道尚少，當(dāng)然僅僅靠COX-2抑制劑不可

5、能對腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生絕對影響，聯(lián)用應(yīng)用COX-2抑制劑是否可增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒性作用和抗淋巴生成效應(yīng)尚不明確。本研究旨在探討吲哚美辛對人肺癌裸鼠移植瘤淋巴轉(zhuǎn)移及VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin、Survivin表達(dá)的影響，以探討肺癌浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制，為臨床預(yù)防、治療肺癌尋求新的方法。
　　 方法：
　　 1、將人肺癌A549細(xì)胞接種于裸鼠皮下建立移植瘤模型，隨機(jī)分為四組(對照組，吲哚美辛一組(1mg/kg/d)

6、，吲哚美辛二組(2.5mg/kg/d)，吲哚美辛三組(4mg/kg/d)，并給予相應(yīng)劑量的吲哚美辛灌胃。給藥42天后，處死裸鼠，切取移植瘤組織，免疫組織化學(xué)檢測VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin蛋白的表達(dá)，實(shí)時熒光定量PCR法檢測腫瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin mRNA的表達(dá)。
　　 2、將人肺癌A549細(xì)胞接種于裸鼠皮下建立移植瘤模型，隨機(jī)分為四組（對照組、吲哚美辛組、奧沙利鉑組、奧沙

7、利鉑和吲哚美辛聯(lián)合用藥組），并給予相應(yīng)的藥物。給藥42天后，處死裸鼠，切取移植瘤組織，免疫組織化學(xué)檢測VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin、Survivin蛋白表達(dá)，實(shí)時熒光定量PCR法檢測腫瘤組織VEGF-C、Survivin mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同劑量吲哚美辛對人肺癌裸鼠移植瘤淋巴轉(zhuǎn)移的治療作用
　　 26只裸鼠成瘤，成瘤率100％，腫瘤細(xì)胞種植后第10天，腫瘤直徑平均達(dá)4

8、mm。以圖像分析系統(tǒng)對VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin蛋白免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行積分光密度測定，方差分析結(jié)果顯示，與對照組比較，吲哚美辛各組VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin表達(dá)水平均明顯降低；與吲哚美辛低劑量組比較，中劑量組和高劑量組VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)水平明顯降低；中劑量組和高劑量組VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)水平無明顯差異；各用藥組之間β-catenin蛋白表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

9、r>　　 將RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)實(shí)時熒光定量分析測定VEGF-C、VEGFR-3、β-cateninmRNA表達(dá)，方差分析結(jié)果顯示，與對照組比較，吲哚美辛各組VEGF-C、VEGFR-3mRNA表達(dá)水平均明顯降低；中劑量組與高劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；β-catenin mRNA方差分析結(jié)果顯示，與對照組比較，各用藥組β-catenin mRNA表達(dá)水平無差異。
　　 2、吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑對人肺癌裸鼠移植瘤淋巴轉(zhuǎn)移的治療作用及

10、化療增敏作用
　　 25只裸鼠成瘤，成瘤率100％，腫瘤細(xì)胞種植后第10天，腫瘤直徑平均達(dá)4mm。以圖像分析系統(tǒng)對VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin、Survivin蛋白免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行積分光密度測定，方差分析結(jié)果顯示，吲哚美辛組及聯(lián)合組VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin、Survivin蛋白表達(dá)水平均較對照組明顯降低；與對照組比較，奧沙利鉑組Survivin表達(dá)水平降低，VEGF-C升高，V

11、EGFR-3與對照組無明顯區(qū)別。
　　 實(shí)時熒光定量PCR法測定VEGF-C，Survivin mRNA表達(dá)，方差分析結(jié)果顯示，吲哚美辛組及聯(lián)合組VEGF-C，Survivin mRNA表達(dá)水平均明顯降低；與對照組比較，奧沙利鉑組Survivin表達(dá)水平降低，VEGF-CmRNA升高。
　　 結(jié)論：
　　 1、吲哚美辛能明顯抑制VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin蛋白，及VEGF-CmRNA，VEGF

12、R-3mRNA的表達(dá)，呈濃度依賴性。提示吲哚美辛從基因和蛋白水平對人肺癌裸鼠移植瘤淋巴管新生具有抑制作用。
　　 2、吲哚美辛單藥或聯(lián)合奧沙利鉑均能明顯抑制人肺癌裸鼠移植瘤VEGF-C，VEGFR-3，β-catenin，SuⅣivin的表達(dá)。提示吲哚美辛可能對抗了奧沙利鉑所引起的VEGF-C的升高，兩藥聯(lián)合應(yīng)用提高了抗腫瘤及抗淋巴轉(zhuǎn)移療效，通過抑制VEGF-C/VEGFR-3和β-catenin/Survivin信號途徑是其可