靶向性凝血蛋白tTF-EG3287選擇性誘發(fā)小鼠原位肝癌血管栓塞.pdf

1、肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、復發(fā)率高、預后差的特點，經肝動脈化療栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）是目前公認的肝癌非手術治療的首選方法。目前臨床上常用的栓塞材料各有優(yōu)缺點，在臨床應用中如何對癥使用尚無統(tǒng)一標準，而且TACE治療能否提高肝癌病人的生存率，仍然存在爭議，TACE治療存在種種缺陷如栓塞不全、缺乏靶向性、毒副作用大、栓塞劑穩(wěn)定性與可控性差和伴隨血管內皮生長因子升高等。因

2、此，發(fā)展新型高效的、具有靶向性、可控性強、無毒的腫瘤血管栓塞劑依然是目前肝癌臨床治療亟待解決的重大問題。
　　針對以上問題，我們計劃采用一種基于靶向性凝血蛋白的選擇性栓塞腫瘤血管的抗腫瘤策略。該方法利用截短的組織因子（truncated tissue factor，tTF，又稱前體凝血酶或凝血蛋白）作為凝血效應因子，腫瘤血管標志物結合配體EG3287為載體，其中EG3287為VEGF165與Neuropilin-1（NRP-1，V

3、EGF的共受體）結合的核心區(qū)域設計出的短肽，構建的靶向性融合蛋白tTF-EG3287能夠通過載體把具有潛在凝血功能的tTF選擇性地傳遞到腫瘤血管，tTF借結合的靶細胞膜平臺恢復凝血酶的活力，并誘發(fā)腫瘤血管凝血反應、血栓形成和栓塞阻斷腫瘤組織的血液供應，從而產生抗腫瘤活性。
　　為了驗證靶向性凝血蛋白tTF-EG3287在原位肝癌的抗腫瘤活性，我們首先通過大腸桿菌BL21(DE3)大量表達tTF-EG3287，破碎菌體得到融合蛋白，

4、經過尿素變性后過鎳柱親和純化，然后將純化后的蛋白透析復性，通過凝血時間測定和FX活化實驗在體外初步研究了該融合蛋白的凝血活性。然后利用H22肝癌細胞株構建小鼠移植性原位肝癌模型，使用Cy5.5熒光標記tTF-EG3287的方法尾靜脈注射原位肝癌模型小鼠中，觀察其在主要臟器和肝癌組織中的分布。最后通過尾靜脈小鼠給藥，組織切片法觀察凝血蛋白對肝癌組織血管的栓塞作用，同時利用免疫組織化學法分析正常組織和肝癌組織中的NRP-1和VEGFR表達情

5、況，評價凝血蛋白tTF-EG3287的抗腫瘤活性。
　　本實驗成功地利用大腸桿菌BL21(DE3)優(yōu)化表達融合蛋白tTF-EG3287，表達的包涵體蛋白經過高濃度尿素變性后過鎳柱純化，純度達到95％，復性濃縮后蛋白濃度達1 mg/ml，凝血時間測定和FX活化實驗證實其具有凝血活性。熒光定位實驗顯示tTF-EG3287能選擇性富集于肝癌組織，免疫化學結果顯示肝癌組織中均高表達NRP-1和VEGFR蛋白，病理學觀察可見tTF-EG32