靶向Neuropilin-1的融合蛋白tTF-EG3287選擇性誘發(fā)腫瘤組織血管栓塞.pdf

1、選擇性栓塞腫瘤組織血管從而誘發(fā)腫瘤組織的缺血性壞死是一種很有前景的抗腫瘤策略。利用導(dǎo)向載體構(gòu)建載體-tTF融合蛋白,將截斷的組織因子tTF選擇性靶向于腫瘤組織血管膜表面,可以誘發(fā)腫瘤組織血管栓塞,阻斷腫瘤營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供給,引發(fā)腫瘤缺血性壞死,發(fā)揮抗腫瘤作用。Neuropilin-1(NRP-1)是相對分子質(zhì)量(Mr)為120-130 kDa的跨膜糖蛋白,被發(fā)現(xiàn)在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上都有高表達(dá)。Neuropilin-1是血管內(nèi)皮生

2、長因子165(VE GF165)的非酪氨酸激酶受體,它的過表達(dá)與腫瘤血管新生和生長相關(guān),因此NRP-1可能成為抗腫瘤治療的靶點。Haiyan Jia等設(shè)計出的短肽EG3287,可以與Neuropilin-1發(fā)生特異性結(jié)合,EG3287是VEGF165的一個片段,它保留了與NRP-1結(jié)合的能力,但不會觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號通路,為此我們用EG3287作為靶向載體構(gòu)建融合蛋白tTF-EG3287,選擇性地誘導(dǎo)腫瘤血管栓塞。為了獲得重組tTF-EG

3、 3287基因及有活性的蛋白產(chǎn)物,我們利用PCR技術(shù)構(gòu)建了EG3287與tTF的融合基因,克隆基因至原核表達(dá)載體pET 32b(+),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過優(yōu)化其表達(dá)條件,實現(xiàn)目的蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體形式表達(dá),用鎳親和層析柱純化目的蛋白,透析法進(jìn)行復(fù)性。凝血實驗和FⅩ活化實驗證實融合蛋白保留tTF部分活化FⅩ和引發(fā)血液凝固的的活性；免疫熒光實驗的結(jié)果顯示,融合蛋白tTF-EG3287能使

4、ECV304細(xì)胞膜帶上紅色熒光,而等摩爾濃度的tTF蛋白不能,說明融合蛋白的EG3287部分保持了生物活性,能與ECV304細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。體內(nèi)實驗顯示融合蛋白tTF-EG32 87能有效抑制鼠源性肉瘤S180的生長,在S180小鼠模型中,tTF-EG3287的抑瘤率可達(dá)到64.6%。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白能選擇性定位于腫瘤組織,并選擇性誘發(fā)腫瘤組織血管栓塞,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死,而對正常組織沒有毒副作用。總之,我們通過基因工程技術(shù)成功