SIRT6抗脂肪肝的形成及其可能機制研究.pdf

1、研究目的：
　　1、構(gòu)建高表達小鼠沉默信息調(diào)節(jié)蛋白6（SIRT6）基因的重組腺病毒 Ad-SIRT6，并在肝癌細胞HepG2中驗證其功能。
　　2、轉(zhuǎn)染Ad-SIRT6的HepG2細胞，用軟脂酸鈉模擬細胞脂肪變性模型。觀察高表達SIRT6能否減少細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，抗脂肪肝的形成。
　　3、研究SIRT6參與肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)的可能分子機制。
　　材料和方法：
　　1、用含10％胎牛血清，1%青霉素和1%鏈霉素的

2、高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎腎細胞株Ad293細胞和用含10%胎牛血清，1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基人肝癌細胞株HepG2細胞。
　　2、通過PCR獲得小鼠SIRT6基因編碼序列，克隆入pAd-track-CMV載體質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pAd-track-CMV-SIRT6，質(zhì)粒DNA測序。
　　3、將重組質(zhì)粒Pme I酶切線性化處理后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy共同電轉(zhuǎn)入大腸桿菌BJ5183中，獲得重

3、組腺病毒質(zhì)粒pAd-SIRT6；該質(zhì)粒用PacⅠ線性化處理后，轉(zhuǎn)染Ad293細胞，在細胞中包裝獲得重組腺病毒Ad-SIRT6。
　　4、將HepG2細胞設(shè)立對照組、Ad-EGFP組和Ad-SIRT6組， RT-PCR和Western blot檢測HepG2細胞轉(zhuǎn)染Ad-SIRT6后SIRT6的mRNA和蛋白表達。
　　5、將HepG2細胞設(shè)立對照組（Con）、高脂組（HF）、Ad-SIRT6+高脂組（AdSIRT6+HF），

4、油紅O染色法定性定量檢測各組細胞內(nèi)脂質(zhì)含量。
　　6、RT-PCR檢測HepG2細胞SIRT6及其下游可能靶分子的mRNA表達，包括參與脂肪酸從頭合成、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和脂肪酸β氧化等過程的相關(guān)因子。
　　結(jié)果：
　　1、測序結(jié)果表明pAd-track-CMV-SIRT6構(gòu)建成功。
　　2、電轉(zhuǎn)重組獲得pAd-SIRT6，PacⅠ線性化處理后轉(zhuǎn)染Ad293，擴增并純化得重組腺病毒Ad-SIRT6，病毒滴度為2.8×101

5、0 pfu/mL。
　　3、RT-PCR結(jié)果顯示，Ad-SIRT6組外源性SIRT6基因表達顯著，其它兩組未見表達。Western blot結(jié)果顯示，Ad-SIRT6組與對照組和Ad-EGFP組相比，SIRT6總蛋白表達量顯著增高(P<0.05)。
　　4、油紅O染色法定性定量測定的結(jié)果表明，Ad-SIRT6+HF組細胞內(nèi)脂質(zhì)含量與HF組相比明顯減少（P<0.001）。
　　5、RT-PCR法檢測，軟脂酸鈉抑制細胞自身

6、SIRT6的表達，而Ad-SIRT6激活它的表達。
　　6、軟脂酸鈉使脂肪酸從頭合成中的重要轉(zhuǎn)錄因子SREBP1及其下游因子的mRNA表達顯著增加；而Ad-SIRT6抑制了SREBP1及其下游因子的mRNA表達；
　　7、軟脂酸鈉抑制 LXR及其下游因子的mRNA表達； SIRT6雖然沒有顯著上調(diào) LXR的mRNA表達，但間接激活了LXR下游因子的mRNA表達。
　　8、軟脂酸鈉抑制PPARα的mRNA表達；而SIRT