OCT4和BIRC5在食管鱗癌中表達(dá)及其雙干擾shRNA協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、[目的]
　　 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一非常復(fù)雜的病理生理過程，涉及多階段多因素參與，發(fā)生機(jī)制仍然不明確，許多研究表明BIRC5選擇性高表達(dá)于多種腫瘤組織，與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)率和病人的低生存率相關(guān)，而在正常組織低表達(dá)或不表達(dá)，沉默其表達(dá)可作為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的策略。然而通過單獨(dú)沉默BIRC5的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并未取得十分滿意的效果。近期研究證明，腫瘤發(fā)生過程中，腫瘤細(xì)胞異常高表達(dá)OCT4以對(duì)維持腫瘤細(xì)胞

2、的干性特征，并促進(jìn)腫瘤的耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。OCT4主要功能是維持胚胎干細(xì)胞特性及其自我更新的功能，阻止腫瘤細(xì)胞分化，越來越多的研究證明，OCT4不僅存在于胚胎干細(xì)胞及生殖細(xì)胞腫瘤，在體細(xì)胞腫瘤中，其與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低生存率也密切相關(guān)。本課題組前期研究證明，OCT4在食管鱗癌組織中呈現(xiàn)團(tuán)塊狀的陽性表達(dá)，雖陽性率不高，但卻與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。在此基礎(chǔ)上本項(xiàng)研究擬聯(lián)合檢測(cè)了OCT4和BIRC5在食管鱗癌的組織標(biāo)本和腫瘤細(xì)胞系中的

3、表達(dá)，構(gòu)建沉默OCT4和BIRC5的雙干擾shRNA質(zhì)粒，探討沉默腫瘤細(xì)胞OCT4和BIRC5基因協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)及其相互調(diào)控的分子機(jī)制。
　　 [方法]
　　 1.免疫組化法：50例臨床食管鱗癌組織、癌旁組織、正常食管粘膜上皮組織標(biāo)本石蠟包埋、切片，檢測(cè)OCT4和BIRC5的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系；
　　 2.干擾質(zhì)粒載體構(gòu)建：根據(jù)GeneBank設(shè)計(jì)OCT4和BIRC5mRNA的

4、干擾序列，采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建特異性沉默OCT4、BIRC5及沉默OCT4/BIRC5雙干擾shRNA，所有質(zhì)粒均帶增強(qiáng)型GFP基因作為熒光標(biāo)記，分別命名為OCT4－shRNA、BIRC5－shRNA，Dual-RNA，無關(guān)對(duì)照質(zhì)粒為Ctr-shRNA；
　　 3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用LipofectamineTM2000將OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA，Dual-RNA，Ctr-shRNA分別轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株Eca10

5、9、TE1，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞檢測(cè)，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)；
　　 4.免疫組化檢測(cè)OCT4與BIRC5在食管鱗癌細(xì)胞系Eca109、TE1中的表達(dá)。收集體外培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞爬片后用兔抗人BIRC5/鼠抗人OCT4和羊抗兔二抗/羊抗鼠二抗孵育，用顯微鏡觀察蓋玻片上細(xì)胞的OCT4和BIRC5表達(dá)；
　　 5.MTT實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48后，進(jìn)行MTT染色，用酶聯(lián)測(cè)定儀在490nm波長檢測(cè)每孔的光密度值(OD值)，檢測(cè)細(xì)胞增

6、殖率=(實(shí)驗(yàn)管OD值/對(duì)照管OD值)×100％；
　　 6.FCM測(cè)定腫瘤細(xì)胞凋亡與周期：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡與周期變化。利用CellQuest軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和資料分析；
　　 7.RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞內(nèi)OCT4和BIRC5的表達(dá)：提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，PCR檢測(cè)OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA，Dual-RNA，Ctr-shRNA等干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后OCT

7、4和BIRC5mRNA的表達(dá)情況；
　　 8.WesternBlot：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，PMSF裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，分離、轉(zhuǎn)膜后，用鼠抗人單克隆IgG抗體/羊抗BIRC5單克隆IgG抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗/辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗檢測(cè)OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA，Dual-RNA、Ctr-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后OCT4和BIRC5蛋白的表達(dá)情況；
　　 9.激光免疫熒光共聚焦

8、顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后OCT4和BIRC5的表達(dá)：轉(zhuǎn)染48hr后，細(xì)胞爬片，中性甲醛固定，用兔抗人BIRC5/鼠抗人OCT4一抗和FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗/Cy3標(biāo)記羊抗鼠二抗孵育，激光免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察蓋玻片上細(xì)胞OCT4/BIRC5的表達(dá)；
　　 [結(jié)果]
　　 1.食管鱗癌組織中OCT4和BIRC5的表達(dá)：免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，OCT4主要著色于細(xì)胞核，BIRC5主要定位于細(xì)胞漿，并且癌組織的陽性比例均明顯高于癌旁

9、組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；
　　 2.OCT4與BIRC5的表達(dá)無顯著相關(guān)性(R=0.276，P＞0.05)；OCT4、BIRC5表達(dá)陽性率與性別、年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯深度無顯著性差異(P＞0.05)；OCT4、BIRC5共同陽性的患者預(yù)后最差，OCT4、BIRC5全陰性的患者預(yù)后最好；
　　 3.食管鱗癌細(xì)胞株Eca109、TE1中OCT4與BIRC5陽性的表達(dá)，OCT4主要定位于細(xì)胞核，B

10、IRC5主要表達(dá)于胞漿；
　　 4.成功構(gòu)建干擾RNA：OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA，Dual-shRNA、Ctr-shRNA通過酶切鑒定表明載體構(gòu)建成功；
　　 5.干擾RNA抑制細(xì)胞增和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：OCT4與BIRC5的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109、TE1后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖、FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，OCT4-shRNA、BIRC5-shRNA均可抑制細(xì)胞增殖和

11、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但Dual-RNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果更明顯(P＜0.01))。
　　 6.OCT4和BIRC5相互調(diào)控的分子機(jī)制：沉默BIRC5基因表達(dá)后，RT-PCR、WesternBlot、激光免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)OCT4、BIRC5蛋白或mRNA，發(fā)現(xiàn)BIRC5mRNA或蛋白表達(dá)下調(diào)后，OCT4基因的表達(dá)無明顯變化，但是沉默OCT4基因，OCT4與BIRC5的表達(dá)量同時(shí)下調(diào)。
　　 [結(jié)論]
　　 OCT4

12、和BIRC5在食管癌鱗癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，在食管鱗癌細(xì)胞株中Eca109、TE1中也呈陽性表達(dá)，OCT4主要定位于細(xì)胞核，BIRC5主要表達(dá)于細(xì)胞漿，兩種基因陽性表達(dá)均是食管鱗癌預(yù)后的不良因素；OCT4、BIRC5的shRNA質(zhì)粒能夠有效沉默相應(yīng)靶基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；雙靶向干擾RNA能夠更有效沉默Eca109、TE1細(xì)胞中OCT4和BIRC5基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)最強(qiáng)，二者具