小檗胺誘導K562細胞凋亡與p210bcr-abl蛋白磷酸化和Hsp90表達的研究.pdf

1、背景：慢性粒細胞白血病(CML)是一種常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，由Ph染色體產生的p210bcr/abl癌性融合蛋白在慢粒惡性表型中起著十分重要的作用。已知，p210bcr/abl癌性融合蛋白必需磷酸化才能發(fā)揮其促進腫瘤細胞增殖、存活以及抑制腫瘤細胞凋亡等生物學功能，而熱休克蛋白90(Hsp90)是p210bcr/abl癌性融合蛋白重要分子伴侶。Gleevec(又稱STI571，Imatinib)是一種能抑制bcr/abl癌性融合蛋白磷酸

2、化而誘導Ph染色體陽性白血病細胞凋亡的靶向性抗白血病藥物。然而，隨著Gleevec在臨床的廣泛應用，發(fā)現(xiàn)有相當一部分白血病患者對Gleevec產生抗藥性而失去療效。因此，尋找新的bcr/abl癌性融合蛋白抑制劑仍然十分必要。我們新近的研究發(fā)現(xiàn)，在臨床上應用的升白細胞藥物小檗胺能抑制p210bcr/abl癌性融合蛋白陽性白血病細胞系K562及CML患者原代白血病細胞的生長并誘導白血病細胞凋亡，并且對Gleevec耐藥的K562細胞的生長同

3、樣具有明顯的抑制作用，但其作用分子機制仍不十分清楚。本研究應用體外細胞培養(yǎng)體系、流式細胞術、免疫印跡和免疫共沉淀等技術和方法，觀察小檗胺對白血病細胞系K562細胞p210bcr/abl癌性融合蛋白磷酸化及其分子伴侶Hsp90等的影響，以探討小檗胺誘導白血病細胞凋亡分子機制。 材料與方法：培養(yǎng)表達內源性p210bcr/abl蛋白的Ph+人慢性粒細胞白血病細胞系K562，用小檗胺按指定時間和劑量干預細胞。應用MTT法檢測細胞活力，求

4、出小檗胺對K562細胞的48hIC50濃度；應用AnnexinV-FLUOS/PI試劑盒和流式細胞術定量分析早期亡細胞百分比；用cytoperm/cytofix和Caspase-3-McAb-PE定量檢測含活化半胱天冬酶-3(Caspase-3)細胞百分比；以免疫共沉淀技術(c-abl抗體)和Western印跡[p-Tyr(pY99)抗體]定量分析p210bcr/abl蛋白磷酸化；p210bcr/abl蛋白總量直接用Western印跡(

5、c-abl抗體)檢測；Hsp90和Hsp70等分子伴侶蛋白水平的變化用Western印跡(Hsp90和Hsp70抗體)檢測。 結果：(1)小檗胺作用K562白血病細胞48h，其50％細胞生存受抑時的半數(shù)抑制濃度(IC50)為8.1μg/ml。 (2)8μg/ml濃度小檗胺作用48h后，45.69％K562白血病細胞表達活化的Caspase-3凋亡分子和48.43％K562白血病細胞發(fā)生凋亡。 (3)免疫印跡和免疫

6、共沉淀結果顯示，低劑量小檗胺可明顯抑制K562白血病細胞內p210bcr/abl蛋白磷酸化：8μg/ml濃度小檗胺處理6h后，K562細胞磷酸化p210bcr/abl蛋白含量僅為對照組的8.41％，而p210bcr/abl蛋白總量并無變化。 (4)小檗胺還能直接下調p210bcr/abl分子伴侶Hsp90蛋白水平：K562白血病細胞經8μg/ml濃度小檗胺處理24h時的Hsp90水平只有對照組的18.37％，而且對能誘導白血病細