曲妥珠單抗對(duì)Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株mTOR信號(hào)通路的影響.pdf

1、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammaliantargetofrapamycin)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶家族(phosphoinositidekinase—relatedkinase，PIKK)，它對(duì)細(xì)胞生長、分化、增殖、遷移和存活都有重要調(diào)控作用。mTOR以兩種復(fù)合物形式存在，分別為mTORC1
　　 (mTOR-raptor復(fù)合物)和mTORC2(mTOR-rictor復(fù)合物)。

2、mTORC1由mTOR、Raptor(regulatory-associatedproteinofmTOR)、mLS8/GβL(Gproteipunit-likeprotein)、PRAS40和Deptor組成，受激素、生長因子、營養(yǎng)、能量、應(yīng)激等刺激激活，并對(duì)雷帕霉素(rapamycin)敏感。mTORC1的激活導(dǎo)致下游信號(hào)40S核糖體蛋白激酶(40SribosomalproteinS6kinase(1)，S6K1)和真核細(xì)胞翻譯起始

3、因子4E結(jié)合蛋白(eukaryoticinitiationfactor-4Ebindingprotein1,4E-BP1)的磷酸化，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、存活、蛋白質(zhì)翻譯、核糖體發(fā)生、自噬等重要生物學(xué)過程。mTORC2由mTOR、Rictor(rapamycin-insensitivecompanionofmTOR)、mLS8/GβL、mSin(l)(SAPKinteractingprotein1)、PRR5/Protor和Dep

4、tor組成，對(duì)雷帕霉素耐受。mTORC2可作用于Akt，但只針對(duì)Akt的Ser473位點(diǎn)，并不影響Akt其他位點(diǎn)。其活化Akt(S473)后可調(diào)控細(xì)胞的生存、代謝、增殖。另外有研究認(rèn)為，mTORC2在如細(xì)胞骨架組織形成等各種生物過程中也有關(guān)鍵作用。
　　 有研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路在多種細(xì)胞生理活動(dòng)如血管生成、胰島素抵抗、脂肪合成以及T淋巴細(xì)胞活化等中呈現(xiàn)過度活化狀態(tài)。也有研究認(rèn)為，在炎癥反應(yīng)中，mTOR信號(hào)通路的激活可以調(diào)控炎

5、癥。近年來，也有研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路在癌癥中高度激活，控制著眾多在腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要的生物學(xué)過程，因此mTOR信號(hào)通路是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。而隨著研究的不斷深入，mTOR信號(hào)通路在多種常見腫瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、白血病及淋巴瘤等發(fā)生發(fā)展中凸顯越來越重要的地位，盡管mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)及其類似物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但mTOR信號(hào)的調(diào)控機(jī)制仍處于探索階段，尚未能完全闡

6、明。
　　 乳腺癌是當(dāng)今女性最常見惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)。在我國，乳腺癌發(fā)病率已位居大城市女性惡性腫瘤的第一位。Her-2是由位于染色體17q21的c-erbB2基因編碼的具有跨膜酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)活性的跨膜糖蛋白，簡稱P185。臨床試驗(yàn)證實(shí)，Her-2在15％～25％的乳腺癌中有基因擴(kuò)增和蛋白過表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞更易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，無病生存期短，預(yù)后較差。曲妥珠單

7、抗(Trastuzumab)是以Her-2為靶點(diǎn)的重組人源化單克隆抗體，與c-erbB2受體細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合，具有高度親和力和特異性阻斷c-erbB2受體而產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。現(xiàn)已廣泛用于治療Her-2過表達(dá)的乳腺癌患者。
　　 目前國內(nèi)在曲妥珠單抗與mTORC1、mTORC2信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)性上并無明確研究。本課題通過利用Her-2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453，旨在探討研究曲妥珠單抗對(duì)mTORC1、mTORC2信號(hào)通路的影

8、響，并觀察在mTOR信號(hào)通路的影響程度上曲妥珠單抗是否優(yōu)于雷帕霉素。
　　 目的：
　　 探討曲妥珠單抗對(duì)Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株mTOR信號(hào)通路的影響，并觀察在mTOR信號(hào)通路的影響程度上曲妥珠單抗是否優(yōu)于雷帕霉素。
　　 方法：
　　 Her-2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453為本實(shí)驗(yàn)室保存，使用1640培養(yǎng)基，添加10％胎牛血清，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長速度適時(shí)更換

9、培養(yǎng)基，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA工作液消化分散細(xì)胞，進(jìn)行傳代或接種培養(yǎng)。
　　 蛋白印跡(WesternBlot)檢測(cè)曲妥珠單抗對(duì)mTORC1和mTORC2信號(hào)通路的影響。將MDA-MB-453細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期后，在6組實(shí)驗(yàn)組中加入濃度分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.5和5.0mg/ml的曲妥珠單抗，設(shè)1組空白對(duì)照組及1組雷帕霉素對(duì)照組(雷帕霉素的濃度為0.1mg/ml)，空

10、白對(duì)照組加入等量生理鹽水，孵育2h后提取蛋白，上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1h，加一抗4℃孵育過夜，加二抗室溫孵育1h，ECL顯色，曝光，洗片。
　　 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(CellCountingKit-8，CCK-8)檢測(cè)曲妥珠單抗對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞增殖的影響。將生長狀態(tài)良好的MDA-MB-453細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔200μl，每組設(shè)5個(gè)平行孔。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，更換

11、新鮮培養(yǎng)基，分別為含生理鹽水的培養(yǎng)基(空白對(duì)照組1組)、含有0.1mg/ml雷帕霉素的培養(yǎng)基(雷帕霉素對(duì)照組1組)和含有濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5和5.0mg/ml的曲妥珠單抗的培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組5組)，繼續(xù)培養(yǎng)3天后，按CCK8試劑盒說明書操作，最后用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值(λ=450nm)。
　　 平板克隆率試驗(yàn)檢測(cè)在曲妥珠單抗的作用下乳腺癌細(xì)胞的克隆形成能力。將細(xì)胞接種于6孔板，每孔密度500個(gè)細(xì)胞，24h之后更換新鮮

12、培養(yǎng)基，1組空白對(duì)照組、5組實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中分別加入生理鹽水和濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠單抗。繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，每48h更換1次新鮮培養(yǎng)基，維持培養(yǎng)2周，2周后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用PBS液沖洗2次，用甲醇室溫固定15min，棄去甲醇，用0.15％結(jié)晶紫染液室溫染色15min，用流水沖洗2次，室溫晾干，拍照統(tǒng)計(jì)克隆形成數(shù)。
　　 顯微鏡下觀察乳腺癌細(xì)胞死亡情況。將生長狀態(tài)良好的MDA-MB-4

13、53細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml，接種于24孔板，24h后待細(xì)胞融合密度達(dá)30％左右時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基，分別為含生理鹽水的培養(yǎng)基(空白對(duì)照組1組)、含有0.1mg/ml雷帕霉素的培養(yǎng)基(雷帕霉素對(duì)照組1組)、含有濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠單抗的培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組4組)和含有0.1mg/ml雷帕霉素及濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠單抗的培養(yǎng)基(聯(lián)合用藥對(duì)照組4

14、組)，繼續(xù)培養(yǎng)。每天同一時(shí)段對(duì)每一孔進(jìn)行隨機(jī)拍照，平均每孔三張照片，連續(xù)觀察6天。
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。細(xì)胞增殖試驗(yàn)、克隆形成試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均用(x)±s表示。如果方差齊，采用方差分析(One-WayANOVA)多組間比較，然后采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，如果方差不齊，采用Welch法多組間比較，然后采用Dunnet'sT3方法進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 We

15、sternBlot結(jié)果顯示:雷帕霉素對(duì)照組的mTOR、S6、4EBP1磷酸化明顯受抑制，實(shí)驗(yàn)組隨曲妥珠單抗?jié)舛鹊脑龃?，mTOR、S6、4EBP1、Akt磷酸化水平越低，并且隨著曲妥珠單抗的濃度增大，其對(duì)乳腺癌細(xì)胞mTOR信號(hào)通路的抑制效果較之雷帕霉素組更加明顯。
　　 CCK8試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示:空白對(duì)照組OD值為1.79±0.07，雷帕霉素對(duì)照組OD值為1.47±0.08，曲妥珠單抗實(shí)驗(yàn)組的OD值依濃度變化分別為1.37±0.

16、11、1.28±0.03、1.03±0.09、0.68±0.09、0.37±0.03，對(duì)上述5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，6組數(shù)據(jù)的方差齊(P=0.083);方差分析的結(jié)果顯示，6組數(shù)據(jù)至少有2組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=221.863，P=0.000)。利用LSD法進(jìn)行兩兩比較，與空白對(duì)照組相比，所有曲妥珠單抗實(shí)驗(yàn)組均可抑制MDA-MB-453細(xì)胞增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P=0.000)。根據(jù)細(xì)胞相對(duì)增殖率公式可得曲

17、妥珠單抗實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞相對(duì)增殖率依濃度變化分別為(77±6.3)％、(71±1.5)％、(57±4.9)％、(38±5.1)％、(21±1.5)％，而雷帕霉素對(duì)照組的相對(duì)增殖率為(82±4.6)％。與空白對(duì)照組相比，雷帕霉素對(duì)照組可抑制MDA-MB-453細(xì)胞增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 6組克隆形成數(shù)據(jù)顯示:對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的均值分別為每孔(519±32)、(283±23)、(140±18)、(110±12)

18、、(83±10)和(19±6)個(gè)，克隆形成率分別為(100±6)％、(55±4)％、(27±3)％、(21±2)％、(16±2)％、(4±1)％。對(duì)上述6組克隆數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，6組數(shù)據(jù)的方差齊(P=0.052);方差分析的結(jié)果顯示，6組數(shù)據(jù)至少有2組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=372.643，P=0.000)。利用LSD法進(jìn)行兩兩比較，與空白對(duì)照組相比，所有曲妥珠單抗實(shí)驗(yàn)組P=0.000。
　　 在顯微鏡下連續(xù)6天觀察細(xì)胞死亡

19、情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞為半懸浮圓形細(xì)胞，呈葡萄串樣生長。使用藥物6天后，不論是單藥曲妥珠單抗組還是聯(lián)合用藥組，細(xì)胞數(shù)目都隨曲妥珠單抗?jié)舛仍龃蠖鴾p少。但單用雷帕霉素從圖片上看并不比曲妥珠單抗效果好，聯(lián)合用藥圖片所見與曲妥珠單抗單藥效果相差也不大，并且2.5mg/ml曲妥珠單抗+0.1mg/ml雷帕霉素藥物組細(xì)胞數(shù)目卻比2.5mg/ml曲妥珠單抗藥物組多。
　　 結(jié)論：
　　 曲妥珠單抗作為針對(duì)Her-2