LncRNA HOTAIR與乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的關系及其機制研究.pdf

1、目的：研究及初步探討HOTAIR與乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的關系及其可能的分子機制。
　　方法：
　　（1）選取乳腺癌細胞系SK-BR-3-TS，通過間歇大劑量沖擊和逐步增加劑量相結合的方法，誘導建立曲妥珠單抗耐藥細胞系SK-BR-3-TR。
　?。?） qRT-PCR檢測SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細胞HOTAIR的表達，MTT法檢測兩種細胞模型腫瘤細胞的增殖活性，流式細胞術檢測細胞凋亡，transwell

2、侵襲實驗觀察細胞侵襲能力，qRT-PCR和western blot分別檢測細胞上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition, EMT）相關基因和蛋白TGF-β、Snail、Vimentin和E-cadherin的表達以及PI3K/AKT/mTOR和MEK/MAPK信號通路活性。
　?。?）甲基化特異性PCR（Methylation-Specific PCR，MSP）檢測兩種細胞TGF-β、PTE

3、N及CNK1B(P27kip1)基因甲基化水平。
　?。?）慢病毒轉染siRNA干擾實驗阻抑SK-BR-3-TR細胞HOTAIR表達，反向驗證HOTAIR與曲妥珠單抗耐藥的關系及其分子機制。
　?。?） BALB/c裸鼠荷瘤體內(nèi)實驗，分別建立SK-BR-3-TS、SK-BR-3-TR和si-HOTAIR-SK-BR-3-TR裸鼠荷瘤模型，觀察三種模型瘤體生長速度；免疫組化技術檢測瘤體TGF-β、Snail和E-cadheri

4、n以及PTEN、Ki67的表達水平。體內(nèi)實驗進一步驗證HOTAIR對曲妥珠單抗耐藥的影響。
　　結果：
　?。?）在成功誘導及穩(wěn)定培養(yǎng)乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞系SK-BR-3-TR中，與曲妥珠單抗敏感細胞株SK-BR-3-TS相比，HOTAIR RNA表達水平明顯上調（2.216±0.332 v0.326±0.05，P=0.0006）。
　?。?） MTT法、transwell侵襲實驗及流式細胞術檢測結果提示，與敏感細

5、胞相比，耐藥細胞增殖活性及侵襲能力增強，細胞凋亡減少。
　　（3） qRT-PCR及WB檢測顯示，與敏感細胞相比，耐藥細胞EMT相關基因TGF-β、Snail及Vimentin表達上調，E-cadherin表達下調，HER2受體信號通路中HER2、PI3K、AKT、mTOR及MAPK基因表達水平及HER2受體磷酸化水平無明顯變化，但p-AKT、p-MAPK及CyclinD1水平升高，而PTEN、P27水平下調。
　?。?）

6、MSP檢測耐藥細胞PTEN基因甲基化水平升高，TGF-β基因甲基化水平下調，而CNK1B(P27kip1)基因甲基化水平未發(fā)生明顯變化。
　?。?）慢病毒介導RNA干擾實驗阻抑耐藥細胞HOTAIR表達后，HOTAIR表達明顯下調。MTT法檢測siHOTAIR-SK-BR-3-TR細胞恢復了對曲妥珠單抗的敏感性，細胞增殖活性及侵襲能力減弱，細胞凋亡比例增加，qRT-PCR及WB檢測細胞EMT相關蛋白TGF-β、Snail及Vimen

7、tin表達下調，E-cadherin表達上調，HER2受體信號通路中HER2、PI3K、AKT、mTOR及MAPK表達水平及HER2磷酸化水平未發(fā)生明顯改變，但p-AKT、p-MAPK及CyclinD1水平下調，而PTEN、P27水平上調。
　?。?） MSP檢測siHOTAIR-SK-BR-3-TR細胞PTEN基因甲基化水平下調，TGF-β基因甲基化水平上調，而CNK1B(P27kip1)基因甲基化水平無顯著差異。
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8、7）成功建立SK-BR-3-TS、SK-BR-3-TR和si-HOTAIR-SK-BR-3-TR裸鼠荷瘤模型。SK-BR-3-TR荷瘤模型瘤體生長速度較SK-BR-3-TS和si-HOTAIR-SK-BR-3-TR模型明顯增快，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。si-HOTAIR-SK-BR-3-TR模型瘤體TGF-β和Snail蛋白陽性表達率（1/6，16.7％；2/6，33.3%）低于SK-BR-3-TR（4/6，66.7%；5/

9、6，83.3%），但差異無統(tǒng)計學意義（Chi-Square tests，F(xiàn)isher’s Exact Test，P=0.242）；E-cadherin及PTEN蛋白陽性表達率較高，但無統(tǒng)計學差異（P=0.242）。Ki67的表達陽性率無差別(均為5/6，83.3%，P=1.000)。
　　結論：
　　曲妥珠單抗耐藥細胞株SK-BR-3-TR中HOTAIR表達上調誘導的TGF-β及PTEN基因去甲基化表觀遺傳修飾，從而分別導致