INK4A通路對人骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)及線粒體功能的調(diào)控作用.pdf

1、目的：觀察INK4A信號(hào)通路對人骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(ScienCell,Cat.NO3510)衰老的誘導(dǎo)及對線粒體功能的影響。
　　方法：在構(gòu)建重組慢病毒載體pLVX-p16ink4a-ZsGreen測定最佳感染復(fù)數(shù)(MultiplicityofInfection,MOI)及監(jiān)測慢病毒表達(dá)時(shí)間的前提下,構(gòu)建重組慢病毒載體pLVX-p16ink4a感染第二代人骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,并用慢病毒空載體pLVX-MCS作陽性對照,PBS作陰性對照。

2、基因轉(zhuǎn)染7天后,用β-半乳糖苷酶染色鑒定細(xì)胞衰老程度,用JC-1染色和流式細(xì)胞儀分別檢測線粒體膜電位水平,用qRT-PCR(RealtimeQuantitativePCR)法測定p16ink4amRNA水平,Westernblotting法測定蛋白水平。
　　結(jié)果：重組慢病毒載體pLVX-p16ink4a-ZsGreen在MOI=60感染人骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞3天左右后即可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,感染效率達(dá)90％以上,到第7天時(shí),熒光效應(yīng)依

3、然明顯。qRT-PCR法與Westernblotting法結(jié)果分別表明攜帶p16ink4a基因的慢病毒載體感染組細(xì)胞p16INK4amRNA與蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。重組慢病毒pLVX-p16ink4a載體感染組(VP16組)細(xì)胞胞漿經(jīng)β-半乳糖苷酶染色后有明顯的藍(lán)染,而對照慢病毒pLVX-MCS空載體感染組(CP16組)和正常細(xì)胞組(NC組)胞漿藍(lán)染微弱。經(jīng)JC-1染色后,VP16組細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,而CP16組和NC組