PARP-1缺失小鼠髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的建立和功能分析.pdf

1、目的：利用PARP—1和p53基因雙缺失的小鼠髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，探討DNA損傷修復(fù)因子Brca1、Nbs1、Ku70、Ku80和Rad51對小鼠髓母細(xì)胞瘤發(fā)生的意義及其相互作用關(guān)系。 方法：對PARP—1和p53基因雙缺失的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，利用免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物在髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)將PARP—1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠髓母細(xì)胞瘤的細(xì)胞系與正常對照細(xì)胞系中，經(jīng)過有限稀釋法選擇

2、熒光較強(qiáng)的細(xì)胞并不斷篩選及克隆化培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達(dá)PARP—1熒光蛋白的細(xì)胞系。利用Western blot技術(shù)檢測髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中PARP—1的表達(dá)，并觀察計(jì)算細(xì)胞增殖情況和染色體數(shù)目。然后用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系中Brca1、Nbs1、Ku80和Rad51的蛋白或RNA在不同細(xì)胞周期的表達(dá)，以分析PARP—1對各因子的作用。 結(jié)果：所建立的小鼠髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，呈多角形

3、、短梭形，免疫熒光分析可見未成熟神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白Vimentin、Dcx、βⅢ-Tubulin等表達(dá)陽性，證明該腫瘤細(xì)胞的神經(jīng)源性；穩(wěn)定表達(dá)PARP—1熒光蛋白的細(xì)胞Western blot檢測PARP—1蛋白陽性；對細(xì)胞系進(jìn)行染色體核型分析表明其細(xì)胞染色體數(shù)為非整倍體；在不同細(xì)胞周期中檢測到DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)途徑中的同源重組(HR)修復(fù)途徑中的Rad51在細(xì)胞周期S期和G2/M期表達(dá)量增高，而非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)途徑中的

4、Ku70、Ku80未發(fā)生明顯變化，DNA損傷修復(fù)的早期基因Nbs1也沒有明顯變化；Brca1基因在穩(wěn)定表達(dá)PARP—1和PARP—1缺失的髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma，MB)細(xì)胞系的細(xì)胞周期的S期和G2/M期表達(dá)增高，且在后者中Brca1表達(dá)量更高。 結(jié)論：成功建立了PARP—1和p53雙缺失的小腦神經(jīng)源性髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和穩(wěn)定表達(dá)PARP—1熒光蛋白的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系；在PARP—1缺失的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，DN