不同亞型流感病毒NS1與PSD-95相互作用及對神經(jīng)元NO的影響.pdf

1、背景：
　　A型流感病毒Non-structrualprotein1(NS1)能與宿主細(xì)胞內(nèi)眾多蛋白相互作用,表現(xiàn)為對宿主的免疫抑制作用,并影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)合成。NS1蛋白含有約230個(gè)氨基酸片段,C-末端4個(gè)氨基酸被稱為PDZ結(jié)合基序(PDZbindingmotif)。突觸后密度蛋白(PostsynapticDensityProteins,PSD-95)主要存在于神經(jīng)元細(xì)胞,含有3個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)區(qū)域(PDZdomain)。PS

2、D-95作為神經(jīng)元細(xì)胞鷹架蛋白,結(jié)合了眾多功能蛋白。PSD-95在神經(jīng)元細(xì)胞離子平衡,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),N-甲基-D-門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartatereceptor,NMDAR)聚集等方面均發(fā)揮著重要作用。
　　目的：
　　為了研究A型流感病毒NS1與PSD-95蛋白之間存在的相互作用及不同亞型流感病毒NS1與PSD-95相互作用的差異;檢測這兩種蛋白結(jié)合作用對神經(jīng)元細(xì)胞功能的影響。利用基因克隆技術(shù),通過GS

3、T-pulldown,酵母雙雜交,免疫共沉淀,免疫熒光定位等技術(shù)來確定不同亞型流感病毒NS1蛋白與神經(jīng)元突觸后密度蛋白PSD-95之間的相互作用。通過測定nitricoxide(NO)含量變化來證實(shí)NS1與PSD-95相互結(jié)合后對神經(jīng)元細(xì)胞功能的影響。
　　方法：
　　通過GST-pulldown證實(shí)NS1與PSD-95在體外的相互結(jié)合;酵母雙雜交及α-半乳糖苷酶活性測定,模擬NS1與PSD-95在體內(nèi)的相互作用;免疫共沉淀

4、,免疫熒光定位確定NS1與PSD-95在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合情況;通過Griessreagent檢測亞硝酸鹽,確定細(xì)胞內(nèi)NO產(chǎn)物含量。結(jié)果:A/Shantou/169/2006(ST169,H1N1)、A/Shantou/602/06(ST602,H3N2)、A/Guangdong/1/2005(GD05,H5N1)、A/Quail/HongKong/G1/97(G1,H9N2)各亞型病毒中,僅H5N1亞型流感病毒的NS1(NS51)

5、能夠與PSD-95相互作用;酵母雙雜交,X-gal,α-半乳糖苷酶活性檢測中,轉(zhuǎn)染PGAD-NS51+PGBK-PSD-95的酵母菌AH109能在-ade/-leu/-trp/-his培養(yǎng)基(quadrupledrop-outmedium,QDO)平板上生長,X-gal強(qiáng)陽性,α-半乳糖苷酶活性單位為3.504±0.082millunit/ml;轉(zhuǎn)染PGAD-NS11+PGBK-PSD-95的AH109在QDO僅極少菌落生長,X-gal

6、弱陽性,α-半乳糖苷酶活性單位為0.184±0.112millunit/ml;(陽性對照:1.252±0.065millunit/ml,陰性對照:0.061±0.023millunit/ml);GST-pulldown,免疫共沉淀試驗(yàn)中,僅NS51與PSD-95存在相互結(jié)合;NO產(chǎn)物檢測,確定NS51與PSD-95相互作用后對神經(jīng)元功能的影響。
　　結(jié)果表明：
　　使用慢病毒lentivirus-NS51感染大鼠海馬神經(jīng)元,

7、NO產(chǎn)生被抑制;pcDNA-NS51,pcDNA-NS11分別轉(zhuǎn)染人神經(jīng)瘤細(xì)胞系SH-SY-5Y,NS51組NO產(chǎn)生被抑制,NS11組NO產(chǎn)生顯著增加。
　　結(jié)論:
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了H5N1亞型流感病毒NS1與神經(jīng)元突觸后密度蛋白PSD-95之間存在相互作用;而其它亞型NS11,NS32,NS92則不能與PSD-95結(jié)合;說明不同亞型流感病毒與PSD-95結(jié)合特性上存在差異;另外,NS1與神經(jīng)元PSD-95相互結(jié)合能夠抑制神經(jīng)

8、元NO的產(chǎn)生。
　　材料與方法：
　　選取由本實(shí)驗(yàn)室提供的A型流感病毒A/Shantou/169/2006(ST169,H1N1),A/Shantou/602/06(ST602,H3N2),A/Guangdong/1/2005(GD05,H5N1),A/Quail/HongKong/G1/97(G1,H9N2),選用流感病毒分離鑒定細(xì)胞系Madin-Darbycaninekidney(MDCK)細(xì)胞,通過空斑形成試驗(yàn)(Pla

9、que-formingassay),得到流感病毒A/Shantou/169/2006(ST169)、A/Shantou/602/06(ST602)、A/Guangdong/1/2005(GD05)、A/Quail/HongKong/G1/97(G1)的空斑形成單位(Plaqueformingunit,PFU)分別為1.2×107PFU/ml、4.2×107PFU/ml、1.1×106PFU/ml、1.0×106PFU/ml;MDCK細(xì)胞

10、使用含10％FBS的DMEM進(jìn)行培養(yǎng),大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞則使用含10%FBS,1%B27的neurobasal培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);構(gòu)建相應(yīng)載體:pGAD-NS11,pGAD-NS32,pGAD-NS51,pGAD-NS92,pGBK-PSD-95,flag-PSD-95,pcDNA-NS11,pcDNA-NS32,pcDNA-NS51,pcDNA-NS92,pcDNA-PSD-95,慢病毒Lentivirus-NS51(NS11表示ST16

11、9的NS1,NS32表示ST602的NS1,NS51表示GD05的NS1,NS92表示G1的NS1)進(jìn)行包括GST-pulldown、酵母雙雜交、免疫共沉淀(Co-IP)在內(nèi)的試驗(yàn)以檢測不同亞型流感病毒NS1與突觸后密度蛋白PSD-95之間的相互作用;其它相關(guān)試劑包括:兔抗PSD-95抗體,小鼠抗NS1抗體,ProteinGmagneticbeads,HRP標(biāo)記的二抗以及Cy3和Alexa488標(biāo)記的羊抗兔,羊抗小鼠二抗;使用碧云天的總

12、Nitricoxide(NO)檢測試劑盒檢測NS1與PSD-95相互結(jié)合后,對細(xì)胞內(nèi)NO含量的影響。
　　結(jié)果：
　　1.空斑形成試驗(yàn)測得ST169(H1N1)、ST602(H3N2)、GD05(H5N1)、G1(H9N2)的空斑形成單位PFU分別為:1.2×107PFU/ml,4.2×107PFU/ml,1.1×106PFU/ml,1.0×106PFU/ml;
　　2.酵母雙雜交試驗(yàn)表明,流感病毒NS51與PSD-9

13、5能夠相互結(jié)合,NS11與PSD-95不存在或僅存在微弱的相互結(jié)合,NS32,NS92與PSD-95則不存在相互結(jié)合;X-gal試驗(yàn)表明,NS51,NS11與PSD-95能夠相互作用,而NS32,NS92與PSD-95則不存在相互作用;α-半乳糖苷酶活性單位檢測表明,NS51與PSD-95能夠相互作用;
　　3.GST-pulldown結(jié)果顯示:NS51與PSD-95能夠相互結(jié)合,而NS11與PSD-95不存在相互結(jié)合;
　

14、　4.Co-IP結(jié)果顯示:僅NS51與PSD-95存在相互結(jié)合;
　　5.免疫熒光結(jié)果表明:神經(jīng)元,SH-SY-5Y細(xì)胞中,NS51與PSD-95存在共定位;
　　6.NO檢測顯示:慢病毒Lentivirus-NS51感染神經(jīng)元細(xì)胞,NS51能夠抑制NO產(chǎn)物的產(chǎn)生;SH-SY-5Y細(xì)胞中,NS51能夠抑制NO產(chǎn)物的產(chǎn)生,而NS11則促進(jìn)NO產(chǎn)物的產(chǎn)生;
　　結(jié)論：
　　1.不同亞型流感病毒NS1與PSD-95存在