bmi-1小發(fā)夾RNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對LoVo細(xì)胞的影響.pdf

1、研究背景與目的：原癌基因bmi-1（bmi-1）是PcG（PcG）家族成員之一，它直接參與細(xì)胞生長、增殖的調(diào)節(jié)。研究證實人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程均與bmi-1基因表達(dá)異常有關(guān)，且與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)。RNA干擾技術(shù)是當(dāng)前研究熱點，特定基因的小干擾RNA能在不影響細(xì)胞正?；蚬δ艿那疤嵯?，沉默腫瘤相關(guān)基因從而起到基因治療的作用。RNAi技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)從基因組學(xué)研究逐步擴(kuò)展到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域并作為基因治療手段。利用RNAi不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)

2、、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定和基因治療等方面開辟一條新思路。 本實驗構(gòu)建針對bmi-1基因的shRNA表達(dá)載體，首先采取脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將帶有熒光標(biāo)記的pEGFP-N1轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞初步判斷轉(zhuǎn)染效率及最適轉(zhuǎn)染細(xì)胞；再將構(gòu)建好的shRNA表達(dá)載體經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞系，用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞系，經(jīng)熒光定量RT-PCR、Western Blot觀察shRNA表達(dá)載體是否抑制l

3、ovo細(xì)胞bmi-1 mRNA與蛋白表達(dá)，經(jīng)MTT與凋亡染色觀察shRNA表達(dá)載體對癌細(xì)胞生長、凋亡的影響。本實驗旨在bmi-1高表達(dá)的腫瘤中，探索能特異性封閉bmi-1的表達(dá)，將可能為腫瘤的基因治療提供新靶點，進(jìn)一步為臨床腫瘤基因治療提供理論依據(jù)。 方法： 1．RT-PCR檢測bmi-1基因在大腸癌組織與癌旁對照組織中的表達(dá)，凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描分析bmi-1基因在大腸癌組織與癌旁對照組織中的表達(dá)情況。 2．根

4、據(jù)siRNA設(shè)計原則，設(shè)計靶向bmi-1小干擾RNA互補(bǔ)寡核苷酸鏈及無義對照序列。 3．將重組載體pSIREN-VEGF-C用內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，電泳鑒定后行膠回收獲得線性化pSIREN-RetroQ載體。 4．將單鏈退火形成互補(bǔ)雙鏈后與線性載體連接，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIREN-bmi-1-2及無義對照序列構(gòu)建成的pSIREN-bmi-1．C；挑取LB平板上的陽性單克隆，雙酶切鑒定正確后送生物

5、公司測序。 5．大腸癌細(xì)胞按照常規(guī)貼壁腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)，并梯度篩選出最佳嘌呤霉素濃度用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 6．用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將帶有熒光標(biāo)記的pEGFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染四種不同大腸癌細(xì)胞，初步判斷轉(zhuǎn)染效率及最適轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 7．采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIREN-bmi-1-1（實驗室保存）、pSIREN-bmi-1-2及無義對照載體pSIREN-bmi-1-C分別轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定

6、轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)。 8．熒光定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染載體前后bmi-1基因在mRNA水平的表達(dá)情況。 9．Western Blot法檢測載體轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞bmi-1蛋白表達(dá)的變化。 10．用MTT比色法檢測pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2、pSIREN-bmi-1-C及空白對照組間增殖能力，并從形態(tài)學(xué)上觀察pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2、pSIREN-

7、bmi-1-C及空白對照組間的差異。 11．用AnnexinⅤ與PI雙染法染色觀察pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2、pSIREN-bmi-1-C及空白對照組間凋亡情況。 結(jié)果： 1．RT-PCR的表達(dá)研究顯示bmi-1 mRNA在癌組織中的表達(dá)高于相應(yīng)癌旁組織，平均表達(dá)率為0．76±0．23、0．35±0．19。 2．利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIREN-bmi-

8、1-2及psIREN-bmi-1-C，重組載體經(jīng)酶切電泳和測序鑒定，證實插入片段的大小、方向均與設(shè)計的一致。 3．在四種不同大腸癌細(xì)胞株中，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將帶有熒光標(biāo)記的pEGFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞LoVo可獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，其轉(zhuǎn)染效率約為50％。 4．嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆大腸癌細(xì)胞的最佳劑量為5ug/ml。 5．熒光定量RT-PCR檢測bmi-1 mRNA水平的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：pSIR

9、EN-bmi-1-2組bmi-1 mRNA水平與pSIREN-bmi-1-C及空白對照組相比，表達(dá)水平顯著降低，bmi-1 mRNA表達(dá)抑制率為80％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-C與空白對照組之間兩兩相比，bmi-1 mRNA表達(dá)水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。 6．Western Blot檢測bmi-1蛋白水平的表達(dá)研究顯示：bmi-1在pSIREN-bmi-1-2組的蛋白表達(dá)低于其它

10、三組的表達(dá)，bmi-1蛋白表達(dá)受抑制，抑制率為82％；但在pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-C、空白對照組的蛋白表達(dá)無明顯差異，可見重組質(zhì)粒pSIREN-bmi-1-2能夠抑bmi-1在蛋白水平的表達(dá)，而重組質(zhì)粒pSIREN-bmi-1-1不具有此作用。 7．細(xì)胞生長曲線顯示：MTT比色法結(jié)果表明pSIREN-bmi-1-2組細(xì)胞與其它三組細(xì)胞比較生長緩慢，而pSIREN-bmi-1-1組、pSIREN-b

11、mi-1-C組對細(xì)胞生長沒有影響。 8．形態(tài)學(xué)檢測各重組載體與空白對照組在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上無明顯差異。 9．細(xì)胞凋亡分析顯示各重組載體與空白對照組比較，不引起細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： 1．半定量RT-PCR顯示bmi-1基因在大腸癌組織的表達(dá)高于癌旁組織。 2．重組載體pSIREN-VEGF-C經(jīng)雙酶切電泳鑒定后行膠回收獲得了線性化載體pSIREN-RetroQ，并成功構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIREN-

12、bmi-1-2及pSIREN-bmi-1-C。 3．在四種大腸癌細(xì)胞株中，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法易于將外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)入的是LoVo細(xì)胞。 4．pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2中，重組載體pSIREN-bmi-1-2抑制了bmi-1基因在LoVo細(xì)胞中mRNA、蛋白水平的表達(dá)，并能夠抑制LoVo細(xì)胞的增殖，但未引起明顯細(xì)胞形態(tài)改變，亦不能引起明顯的細(xì)胞凋亡；而重組載體pSIREN-bmi-1-1不能抑制