黃顙魚RNA-seq轉(zhuǎn)錄組分析及維生素D3對(duì)鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)載體slc34a2表達(dá)影響的研究.pdf

1、為了進(jìn)一步地提高魚體對(duì)磷的利用率和減少磷的排放，本實(shí)驗(yàn)在低磷飼料的基礎(chǔ)上通過添加不同濃度的維生素D3（VD3）來研究黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）魚體中與VD3代謝和功能有關(guān)的基因和VD3對(duì)slc34a2表達(dá)的影響。12周的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別取0和5000 IU/kg VD3兩組黃顙魚的腸、腎臟和肝臟組織，在提取總RNA，當(dāng)RNA的質(zhì)量達(dá)到測(cè)序的要求后，取等量RNA進(jìn)行混合均勻，最后上機(jī)進(jìn)行RNA-seq測(cè)序

2、。這為以后探討魚體腸和腎臟中調(diào)控slc34a2表達(dá)的分子網(wǎng)絡(luò)，闡明低磷餌料中添加VD3對(duì)魚體主動(dòng)吸收磷的機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。獲得的結(jié)果如下：
　　(1)黃顙魚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果理想，測(cè)序質(zhì)量較高。經(jīng)Trinity軟件組裝得到了64056770條 Unigenes，其中包括22665 Distinct Clusters和57796 Distinct Singletons；Unigenes的平均長(zhǎng)度和N50分別是1100 nt和2017

3、nt；將Unigenes序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)發(fā)現(xiàn)分別有43051、42791、39132、32699、15377和27848個(gè)Unigenes得到注釋；通過Nr注釋的黃顙魚 Unigenes物種統(tǒng)計(jì)圖，發(fā)現(xiàn)注釋到最多基因的物種是斑馬魚（58.64％），表明斑馬魚的基因組可以作為黃顙魚的參考基因組;同時(shí)，也在23865 Unigenes中發(fā)現(xiàn)了32206個(gè) SSRs位點(diǎn)；

4、KEGG代謝通路分析表明有32699 Unigenes被分配到了259條生物通路中。
　　(2)通過對(duì)黃顙魚轉(zhuǎn)錄組的Unigenes篩選，得到了6個(gè)與VD3功能和代謝有關(guān)的基因，其中包括vdr, rxr, cyp27a1, cyp2r1, cyp27b1和 cyp24a1。
　　(3)在黃顙魚腸和腎臟組織中克隆得到2條slc34a2基因亞型,命名為腸slc34a2a2亞型和腎臟 slc34a2b亞型，并對(duì)其 cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行

5、了生物信息學(xué)分析。預(yù)測(cè)黃顙魚SLC34A2A2和SLC34A2B蛋白質(zhì)序列分別與鯉魚Cyprinus carpio（75.4%）和青鳉 Oryzias latipes（55.9%）最相似；與黃顙魚SLC34A2A1（在我們已發(fā)表的文章中稱為SLC34A2）蛋白的相似度分別達(dá)到65%和53.8%。對(duì)SLC34A2蛋白的跨膜域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SLC34A2A2和SLC34A2B分別有11和9個(gè)跨膜域，且蛋白的N-端和 C-端分別在胞外和胞內(nèi)。

6、多重序列比較黃顙魚的3種SLC34A2亞型，發(fā)現(xiàn)在3種SLC34A2亞型中ICL-1和ECL-3非常的保守，而最大的不同是在 ECL-2， N-和 C-端的區(qū)域；在 SLC34A2A1， SLC34A2A2和SLC34A2B蛋白最大ECL-2中發(fā)現(xiàn)分別有6個(gè)，5個(gè)和3個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)，除此之外，在3種亞型的C-端也發(fā)現(xiàn)了十分保守的PDZ結(jié)合基序。與SLC34A2B蛋白相比，SLC34A2A2和SLC34A2B蛋白在C-端有一段保守的

7、半胱氨酸序列。
　　(4)運(yùn)用qPCR分析了slc34a2 mRNA在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明slc34a2a2 mRNA主要在腸中表達(dá)，而slc34a2b mRNA主要在腎臟中表達(dá)，其次是肌肉和皮膚。
　　(5)本文也研究了在低磷飼料中添加不同劑量0,324,1243,3621,8040，27000 IU/kg的VD3對(duì) slc34a2 mRNA表達(dá)的影響。與對(duì)照組相比，腸slc34a2a1 mRNA表達(dá)在324,1