重組BCG-hIFN-a-2b凍干及生物活性和安全性的研究.pdf

1、目的：基因工程菌-----rBCG-hIFN-a-2b真空冷凍干燥保存的可行性研究，探索冷凍干燥工藝參數(shù)，為臨床提供易保存、易運(yùn)輸、穩(wěn)定、安全的凍干重組BCG疫苗。本課題著重比較分析了真空冷凍干燥法對(duì)重組BCG的活菌數(shù)、形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、外源性蛋白—人干擾素-a-2b的表達(dá)情況的影響，研究冷凍干燥過程對(duì)基因工程菌------rBCG-hIFN-a-2b中質(zhì)?；蚍€(wěn)定性的影響。并且研究rBCG-hIFN-a-2b的生物安全性問題。

2、方法：采用真空冷凍干燥法保存rBCG-hIFN-a-2b，篩選最佳工藝參數(shù)，繪制冷凍干燥曲線。用平板計(jì)數(shù)法比較冷凍干燥前后rBCG-hIFN-a-2b的活菌數(shù)，計(jì)算存活率?？顾崛旧箫@微鏡下比較分析凍干前后rBCG-hIFN-a-2b的形態(tài)。連續(xù)測(cè)定凍干前、后重組BCG的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。在24孔板中加入含卡那霉素的Middlebrook7H9，分別擴(kuò)增培養(yǎng)凍干后rBCG-hIFN-a-2b單克隆菌落，然后用PCR方法擴(kuò)增hIFN-

3、a-2b的基因片斷，1％瓊脂糖凝膠電泳，用上述方法來分析基因工程菌----rBCG-hIFN-a-2b質(zhì)粒的穩(wěn)定性。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定凍干前后rBCG表達(dá)外源性蛋白——IFN-a-2b的情況。8只結(jié)核菌素試驗(yàn)陰性的豚鼠，皮下接種凍干前后重組BCG，觀察其精神狀態(tài)、活動(dòng)、體重變化，六周后解剖，肉眼觀察各臟器，做組織病理切片、HE染色、鏡檢。 結(jié)果：篩選出合適的凍干參數(shù)，成功制備了凍干重組BCG菌苗。凍干前活菌數(shù)為

4、1×107cfu/ml，凍干后活菌數(shù)為6.5×106cfu/ml，存活率為65％左右。凍干前后重組BCG形態(tài)、生長(zhǎng)率無明顯變化。48個(gè)凍干重組BCG單克隆菌落中，有4個(gè)單菌落出現(xiàn)卡那霉素抗性丟失現(xiàn)象，保留卡那霉素抗性的44個(gè)單菌落中，隨機(jī)取5個(gè)經(jīng)PCR均可檢測(cè)到IFN-a-2b基因片斷，因此質(zhì)粒保留率為91.7％，質(zhì)粒脫失率為8.3％。ELISA測(cè)定凍干前后相同OD值rBCG-hIFN-a-2b分泌IFN-a-2b的量沒有明顯差別。皮下

5、注射凍干前、后重組BCG，豚鼠未出現(xiàn)精神、活動(dòng)異常，而且體重明顯增加。解剖各臟器肉眼均未見結(jié)核結(jié)節(jié)或干酪樣壞死。鏡檢可見注射局部和肺部偶有類上皮樣細(xì)胞聚集現(xiàn)象。 結(jié)論：國(guó)內(nèi)首次成功制備了基因工程菌-----rBCG-hIFN-a-2b菌苗的凍干制劑。證明真空冷凍干燥法能很好的保存基因工程菌-----rBCG-hIFN-a-2b，活菌數(shù)滿足免疫治療所需活菌數(shù)＞100萬的要求，凍干后疫苗的形態(tài)、生長(zhǎng)情況和表達(dá)外源性蛋白—人干擾素-a