重組hIFN-α-2b-BCG菌苗對(duì)膀胱腫瘤免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來的小劑量BCG和干擾素-α聯(lián)合灌注的方案在治療膀胱淺表腫瘤、預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)方面顯示出了較好的耐受性和較高的完全反應(yīng)率<'[1][2][3]>，在鼠的膀胱癌模型試驗(yàn)中也顯示，BCG和干擾素-α聯(lián)合應(yīng)用的療效均優(yōu)于二者單獨(dú)應(yīng)用<'[4][5]>。BCG與干擾素-α聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，由于降低了BCG用量，從而減輕了其毒副作用又保持了其抗腫瘤活性，同時(shí)，降低了干擾素-α大劑量反復(fù)灌注產(chǎn)生的高昂費(fèi)用。雖然到目前

2、為止干擾素-α提高 BCG 抗腫瘤作用的確切機(jī)制尚未清楚，但最近研究結(jié)果顯示，干擾素-α可在以下幾方面提高 BCG 的免疫活性：①協(xié)同免疫細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-<,γ>、IL-2<'[19]>、IL-6、IL-8、GM-CSF 和 TNF-α等細(xì)胞因子產(chǎn)生<'[6][7]>；②活化T細(xì)胞增殖；③提高對(duì)膀胱腫瘤的直接作用，如直接抑制生長(zhǎng)等。 為了解決聯(lián)合灌注中干擾素半衰期短、用量大的缺點(diǎn)，自身能分泌細(xì)胞因子的重組BCG成為了新的研究熱點(diǎn)

3、。隨著基因重組與分子克隆技術(shù)發(fā)展與進(jìn)步，一種能夠在 Escherichia-coli 和 BCG 共同復(fù)制外源基因的載體，以及載體上HSP(heat-shock protein，熱休克蛋白)啟動(dòng)子和SS(信號(hào)序列)的發(fā)現(xiàn)，開始使重組BCG能夠有效的表達(dá)不同的細(xì)胞因子、標(biāo)志蛋白和抗原，重組BCG進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代。重組BCG以野生型BCG作為工程菌，利用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胍吧虰CG中，依靠BCG在宿主內(nèi)復(fù)制，表達(dá)多種外源抗原，以

4、誘導(dǎo)對(duì)多種疾病的特異性體液和細(xì)胞免疫。這種基因工程BCG疫苗與分枝桿菌佐劑加病原體抗原配制的混合疫苗相比，重組BCG集佐劑和載體于一身，兼多種外源基因與活疫苗于一體，一次接種可獲得強(qiáng)而持久的多種特異性免疫。 重組BCG的成功構(gòu)建也引發(fā)了新的課題，就是其體外生物學(xué)行為、細(xì)胞因子表達(dá)的穩(wěn)定性、菌苗體外的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用及活化誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性、體內(nèi)對(duì)腫瘤的治療作用及全身和局部的免疫效應(yīng)等等問題，本課題的目的就是分別采用體內(nèi)外

5、實(shí)驗(yàn)，探討重組 hIFN-a-2b-BCG 菌苗的抗腫瘤效果及其作用機(jī)制，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1、重組hIFN-a-2b-BCG 對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié) (1)測(cè)定重組BCG上清液中hIFN-a-2b的含量，與外源性hIFN-a-2b比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組BCG上清液IFN-a-2b濃度相當(dāng)于5000IU/ml。 (2)分離人外周血中的單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood monocytes，PBM

6、C)，將其和0.01OD 終濃度的重組BCG、野生型BCG以及野生型BCG聯(lián)合干擾素-a共同培養(yǎng)，用MTT法測(cè)定PBMC增殖，并用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中TH1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-a分泌水平。比較重組BCG與野生型BCG對(duì)PBMC誘導(dǎo)活化的不同效果；與野生型BCG聯(lián)合干擾素組對(duì)比，比較一次性外源性干擾素的加入和重組BCG持續(xù)表達(dá)IFN-a-2b的作用效果。結(jié)果表明，重組BCG自身持續(xù)分泌IFN-a-2b對(duì)PBMC活

7、化效果明顯，PBMC增殖在72小時(shí)達(dá)峰值，增殖比例為4.96倍，高于野生BCG的2.5倍和野生型BCG聯(lián)合干擾素組的3.6倍。tH1型細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果也得到同樣的結(jié)論，測(cè)定PBMC活化表達(dá)IFN-γ的量峰值達(dá)到2977pg/ml、IL-12為292pg/ml、TNF-a 為 7914pg/ml，高于野生型BCG測(cè)定結(jié)果，且重組BCG活化PBMC效果強(qiáng)而持久，明顯優(yōu)于一次性干擾素的加人效果。 (3)對(duì)重組BCG上清液IFN-a-2

8、b與等量外源性干擾素誘導(dǎo)tH1型細(xì)胞因子的生成水平進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上清液IFN-a-2b與等量的外源性干擾素生物學(xué)活性相近。 2、重組hIFN-a-2b-BCG 抗膀胱腫瘤細(xì)胞效應(yīng)的體外研究 (1)不同濃度重組BCG活化PBMC生成rBAK(Recombinant bacillusCalmette-Guerin activated killer)細(xì)胞，與人膀胱腫瘤細(xì)胞EJ共同培養(yǎng)，采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢

9、測(cè)rBAK 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，結(jié)果顯示，未經(jīng)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞殺傷活性明顯低下(7.6％)，不同濃度的野生型BCG活化的BAK(bacillus Calmette-Guerin activated killer)細(xì)胞殺傷活性為12.38～20.89％；野生BCG 與干擾素聯(lián)合組活化效應(yīng)細(xì)胞殺傷活性為15.78～34.72％；重組BCG活化的rBAK細(xì)胞殺傷效果達(dá)到實(shí)驗(yàn)組最高，為20.31-51.22％，與野生型BCG組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

10、異。 (2)重組BCG與膀胱腫瘤細(xì)胞(EJ、MB49)共同培養(yǎng)，光鏡下可見腫瘤細(xì)胞變圓，增殖速度明顯減緩，部分細(xì)胞脫壁，胞漿可見大量空泡和顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞周圍有菌群包繞，；透射電鏡下可見腫瘤細(xì)胞表面微絨毛脫落，染色質(zhì)溶解，細(xì)胞質(zhì)壞死，出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞表面有出泡現(xiàn)象；吖啶橙染色可見腫瘤細(xì)胞聚集成團(tuán)狀細(xì)胞球體，胞突消失，細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體出現(xiàn)；Hoechst33258 染色后熒光顯微鏡下可見大量腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光，

11、表明重組BCG成功誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 (3)重組BCG與EJ細(xì)胞共同培養(yǎng)后48小時(shí)DNA電泳出現(xiàn) DNA Ladder，表明EJ 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。 (4)MTT法測(cè)定重組BCG對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞(EJ、MB49)的抑制效應(yīng)，結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)隨著共同培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不同程度的被重組BCG所抑制，且抑制率高于野生型BCG。 (5)重組BCG誘導(dǎo)MB49細(xì)胞凋亡的流式測(cè)定，24小時(shí)檢測(cè)，野生型BCG誘導(dǎo)凋亡率為10.81

12、％，而重組BCG誘導(dǎo)凋亡率達(dá)19.71％；48小時(shí)檢測(cè)，野生型BCG為20.94％，重組BCG為46.58％，二者比較有顯著性差異(P<0.05)。 (6)流式細(xì)胞檢測(cè)表明，重組BCG與小鼠膀胱腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)后，上調(diào)MB49細(xì)胞MHC-I 抗原的表達(dá)，具有時(shí)間依賴性，且上調(diào)比例明顯高于野生型BCG，表明重組BCG有效提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，誘導(dǎo)免疫攻擊。 3、重組hIFN-a-2b-BCG 對(duì)原位膀胱腫瘤小鼠模型治療效

13、應(yīng)的研究 (1)成功構(gòu)建了C57BL/6 原位膀胱腫瘤小鼠模型，重組BCG灌注治療組的小鼠平均膀胱重量顯著低于PBS對(duì)照組，與野生型BCG治療組、野生BCG+IFN治療組相比雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但重組BCG治療組的小鼠生存率高于野生型BCG治療組，提示重組BCG對(duì)膀胱腫瘤的預(yù)后有一定的關(guān)系。 (2)采用流式細(xì)胞儀對(duì)小鼠膀胱灌注治療后的淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分析，并測(cè)定小鼠血清中mTNF-a和 mIL-12 的水平，了解小鼠全身免疫

14、狀況。結(jié)果顯示重組BCG 灌注治療后小鼠外周血CD4<'+>T 細(xì)胞的比例明顯增高，而CD8<'+>T細(xì)胞的比例則無(wú)明顯變化，CD4<'+>/CD8<'+>比例大幅提高，糾正了荷瘤小鼠治療前普遍存在的比例失調(diào)；荷瘤小鼠的外周血中TH1型細(xì)胞因子mTNF-a和mIL-12水平灌注治療后大幅提高，表明重組BCG灌注具有增強(qiáng)荷瘤小鼠細(xì)胞免疫的作用。 (3)腫瘤組織冰凍切片進(jìn)行T細(xì)胞亞群的免疫組織化學(xué)分析，了解重組BCG灌注治療后膀胱局

15、部免疫反應(yīng)。重組BCG組的瘤組織內(nèi)CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>檢測(cè)強(qiáng)陽(yáng)性，說明有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局部免疫反應(yīng)明顯。 (4)免疫組化檢測(cè)P53和Fas在小鼠膀胱腫瘤中的表達(dá)。荷瘤小鼠膀胱腫瘤表達(dá)Fas為弱陽(yáng)性，而重組BCG灌注后Fas呈明顯的陽(yáng)性表達(dá)，表明重組BCG可以顯著提高Fas在膀胱腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的免疫原性；荷瘤小鼠膀胱腫瘤P53表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，腫瘤浸潤(rùn)迅速，惡性度高，重組BCG灌注治療后，P

16、53表達(dá)顯著下降，提示重組BCG與防止腫瘤惡性度增高有一定的關(guān)系。 通過以上研究，本文認(rèn)為，重組 hIFN-a-2b-BCG 具有調(diào)節(jié)人外周血淋巴細(xì)胞增殖、活化 TH1 型細(xì)胞因子表達(dá)的能力，誘導(dǎo)殺傷膀胱腫瘤細(xì)胞；自身可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡，上調(diào)腫瘤細(xì)胞 MHC-I 抗原的表達(dá)；在小鼠體內(nèi)具有調(diào)節(jié)系統(tǒng)及局部免疫能力的作用，糾正荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞亞群的比例失調(diào)，增強(qiáng)局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，上調(diào)荷瘤小鼠Fas的表達(dá)，誘導(dǎo)