課題一ALB1基因?qū)熐咕悄ふ掣搅τ绊懙难芯?課題二小鼠角膜抑制白色念珠菌增殖的機制初探.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：ALB1基因?qū)熐咕悄ふ掣搅τ绊懙难芯?br>　　 目的：探索煙曲霉菌ALB1基因在真菌與角膜粘附中的作用，為闡明真菌與角膜相互作用的分子機制提供資料。
　　 方法：
　　 分別利用煙曲霉菌野生型菌株(B5233)與基因突變株(△alb1)孢子粘附單層角膜上皮細胞及角膜的體外器官和體內(nèi)動物模型，通過檢測細胞和角膜上粘附孢子的數(shù)量，確定ALB1基因突變對煙曲霉菌角膜粘附力的

2、影響。
　　 1．比較兩種菌株在單層角膜上皮細胞的粘附量
　　 將生長良好的角膜上皮細胞(HCEC)，接種于24孔板，每孔1×105個細胞，培養(yǎng)6-8小時細胞貼壁，后換無血清培養(yǎng)液過夜。加真菌孢子懸液，真菌孢子量與細胞量比例為10:1，37℃、飽和濕度5％ CO2的培養(yǎng)箱中孵育60min，用生理鹽水沖洗三次，孔中加熒光白染色30s，熒光顯微鏡照相。再加細胞裂解液裂解上皮細胞，樣品按不同稀釋度均勻涂布于沙氏培養(yǎng)基平板上，3

3、7℃培養(yǎng)24h，計數(shù)形成的菌落。實驗重復3次。
　　 2．小鼠眼器官模型觀察兩種菌株粘附量的區(qū)別
　　 Balb/c小鼠5只，經(jīng)處理后取出眼球，置于96孔板內(nèi)。10只眼分為兩組，兩組孔中分別加入B5233與△alb1真菌孢子懸液（濃度1×109CFU/ml），置于37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱中孵育30min。取出眼球，用生理鹽水沖洗三次，每組3只眼球檢測載菌量；另2只眼球中性甲醛固定，石蠟包埋，切片后糖原染色(PAS染色

4、)觀察孢子粘附情況。實驗重復5次。
　　 3．體內(nèi)實驗比較兩種菌粘附力的區(qū)別
　　 8-10周Balb/c小鼠10只，分為兩組，每組5只。腹腔麻醉，用濾紙片擦拭角膜表面，再將約0.5cm長的輸液管套在小鼠眼球上，縫線固定。管內(nèi)加0.5％EDTA20μl，作用1h。移液器吸去EDTA后，兩組分別加入兩種菌株的真菌孢子懸液（濃度1×109CFU/mL）10μl，作用1h，去除套管，頸椎脫臼處死小鼠，摘取眼球用生理鹽水洗三次。

5、每組3只眼球用于載菌量檢測，計數(shù)形成的菌落；另2只眼球用中性甲醛固定，石蠟包埋，糖原染色（PAS染色）觀察孢子粘附。實驗重復2次。
　　 結(jié)果：
　　 1．角膜上皮細胞粘附實驗檢測兩種菌株粘附量的區(qū)別
　　 ①熒光顯微鏡圖片可見B5233菌株的粘附密度明顯高于△alb1菌株。
　　 ②真菌負荷檢測，其中B5233菌株組粘附數(shù)量為151635±27330個/孔(CV=18.O％)，△alb1菌株組粘附數(shù)量為

6、63333±15756個/孔(CV=24.9％)， B5233菌株粘附率大于△alb1菌株。且兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 2．眼器官模型檢測兩種菌株的角膜粘附量區(qū)別
　　 真菌負荷檢測，兩種菌株粘附量分別為1676±313個/器官、675±102個/器官。 B5233菌株粘附率大于△alb1菌株，且兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。3．動物實驗比較兩種菌株的角膜粘附量
　　 經(jīng)真菌負荷檢

7、測，其中B5233菌株組粘附數(shù)量為680±21個/角膜（CV=17.8％），△alb1菌株組粘附數(shù)量為314±45個/角膜（CV=14.3％）。B5233菌株粘附率大于△alb1菌株。且兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：ALB1基因的突變使真菌孢子對角膜上皮細胞和在體及體外角膜的粘附力下降。
　　 第二部分：小鼠角膜抑制白色念珠菌增殖的機制初探
　　 目的：研究小鼠角膜抑制白色念珠菌生長的機制

8、
　　 方法：小鼠角膜勻漿液上清和滅活真菌孢子裂解液刺激的人角膜上皮細胞、人角膜基質(zhì)細胞培養(yǎng)上清分別與白色念珠菌共培養(yǎng)，每6h測600nm光密度(OD)值一次，最后根據(jù)各點測得的OD值繪制真菌的生長曲線。角膜勻漿液與白色念珠菌共培養(yǎng)2h、4h、6h后用PI染色，激光共聚焦顯微鏡照相，觀察死亡真菌(PI染色陽性)比例。
　　 結(jié)果：
　　 1．角膜勻漿液上清對白色念珠菌生長曲線的影響
　　 角膜勻漿液上清與

9、白色念珠菌共培養(yǎng)的30小時，實驗組在6h后每個時間點上的OD值均高于對照組。
　　 2.HCEC細胞培養(yǎng)上清對白色念珠菌生長曲線的影響
　　 HCEC細胞加滅活的菌液刺激后收集的細胞培養(yǎng)上清與白色念珠菌共培養(yǎng)。真菌生長曲線表明HCEC培養(yǎng)上清對真菌生長沒有任何作用。
　　 3.HTK與U937細胞培養(yǎng)上清對白色念珠菌生長曲線的影響
　　 用滅活的真菌裂解液對HTK與U937細胞的共培養(yǎng)體系進行刺激，收集的

10、培養(yǎng)上清分別與白色念珠菌共培養(yǎng)30小時，實驗組真菌的生長曲線也表明對菌液生長沒有任何作用。
　　 4．角膜勻漿液上清對白色念珠菌存活的影響
　　 角膜勻漿液與白色念珠菌共培養(yǎng)2h、4h、6h后用PI染色，三個時間點均未見有角膜裂解液有促進或抑制孢子死亡的作用，但在作用4h、6h時，可見角膜裂解液促進真菌孢子萌發(fā)出芽。
　　 結(jié)論：角膜對真菌具有天然的防御能力，只有當這種天然防御被破壞時（如角膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性被破