IKKε在2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝中的表達和意義.pdf

1、目的:研究2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus, T2DM)合并非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)個體的炎性因子及肝臟中IKKε的表達及意義,從而在分子水平上證實IKKε在T2DM合并NAFLD中的表達,并進一步推斷其參與免疫炎癥反應的機制,為今后研發(fā)肥胖、糖尿病等方面的新藥打下基礎。
　　方法:60只雄性SD大鼠隨機分為對照組和模型組,模型組再

2、分為T2DM組、NAFLD組、T2DM合并NAFLD組。用高糖高脂飲食誘導后腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)的方法復制2型糖尿病模型。采用改良高糖高脂飲食喂養(yǎng)復制非酒精性脂肪肝模型。以注射鏈脲佐菌素48小時后隨機血糖大于16.7mmol/L并維持一周作為2型糖尿病成模標準。肝臟組織活檢光鏡下見大鼠肝細胞內(nèi)彌漫大量的脂肪空泡作為非酒精性脂肪肝成模標準。每周測量大鼠體重,實驗結束時,測定空腹血糖(fasting

3、blood gulcose,FBG),主動脈取血,稱量肝臟濕重,計算肝指數(shù),肝臟取材行光鏡、電鏡觀察肝臟病理組織學改變。采用全自動生化分析儀檢測谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、高敏C反應蛋白(high sensitive C reactive protein, hs-CRP)、甘油三酯(triglyceride, TG

4、)以及總膽固醇(total cholesterol, TC)。采用雙抗體放射免疫分析法測定血清空腹胰島素(fasting insulin, FINS)。酶聯(lián)免疫(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法測定血清脂聯(lián)素(adiponectin, APN)、游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平的變化。采用免疫組化檢測IKKε和NF-κB p65在肝臟中的表達情況,逆轉錄聚合酶

5、鏈反應(RT-PCR)法和Western blotting法檢測肝臟組織IKKε的表達。最后利用SPSS19.0軟件包對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:(1)肉眼觀及光鏡檢查對照組:肉眼觀,正常對照組大鼠肝臟形態(tài)大小正常,邊緣銳利。光鏡下,肝細胞胞核大而圓,居中央,胞漿豐富,肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。T2DM組:肉眼觀,2型糖尿病組肝臟稍飽滿,邊緣稍圓鈍,質地稍脆。光鏡下,肝小葉結

6、構基本完整清晰,肝細胞濁腫明顯,部分肝細胞體積增大。NAFLD組、T2DM合并NAFLD組:肉眼觀,肝臟增大明顯,邊緣鈍,質軟脆,色發(fā)黃,部分肝臟表面呈花斑狀改變,觸之有油膩感。光鏡下,可見彌漫性肝細胞脂肪空泡變性,肝細胞腫脹明顯,細胞核被擠到一側。(2)電鏡檢查對照組:肝細胞胞核呈圓形,胞漿內(nèi)無明顯脂滴形成,胞漿內(nèi)線粒體豐富。T2DM組:肝細胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少,胞漿內(nèi)偶見脂滴形成。NAFLD組、T2DM合并NAFLD組:肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大

7、量脂滴聚集,有互相融合現(xiàn)象,線粒體體積增大,出現(xiàn)多形性線粒體。(3)炎性因子檢測:與對照組比較各模型組血清APN含量均降低,FFA及hs-CRP含量均顯著升高(P<0.01)。模型組之間相比較,T2DM合并NAFLD組的APN、FFA、hs-CRP表達均高于T2DM組及NAFLD組(P<0.05)。(4)免疫組化檢測:IKKε和NF-κB p65在對照組中幾乎不表達,在模型組中呈高表達,其表達陽性程度以T2DM組、NAFLD組、T2DM

8、合并NAFLD組逐漸升高。IKKε主要定位于胞漿中,胞漿呈黃褐色。NF-κB p65主要定位于胞漿(和/或胞核)中,陽性表達呈黃褐色。各組之間表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(5)RT-PCR和Western blot檢測各組肝臟組織IKKε的表達:模型組表達量均高于正常對照組,模型組中,T2DM合并NAFLD組IKKε的表達量最高,其次為NAFLD組,T2DM組表達量最低。各組表達量有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。(6)IKKε與