應用全血細胞因子譜評估腎移植受者免疫狀態(tài).pdf

1、研究背景：
　　 腎移植是治療終末期腎臟疾病的重要方法。由于腎臟供體是受者同種異體抗原的持續(xù)來源,排斥反應是腎移植術(shù)后造成移植腎損傷的最直接和最重要的因為,是移植成敗的最主要因為,因此,抗排斥治療同腎臟供體一樣將與受者相伴。為了預防和治療排斥反應,環(huán)孢素(CsA),FK506、驍悉(MMF)等小分子藥物以及抗CD3、抗CD25等抗體類免疫抑制劑相繼問世,極大提高了移植成功率,大大促進了移植學的發(fā)展。然而,抗排斥藥是把雙刃劍,它可

2、以保護腎臟免受免疫損傷,同樣也可以導致嚴重感染而使患者死亡。因此,如何把握免疫抑制劑的用量,在排斥和感染之間找到平衡點是目前腎移植以及所有器官移植的重要難題。
　　 液態(tài)懸浮芯片技術(shù)為快速測定多種細胞因子提供了技術(shù)保障。由于體內(nèi)免疫細胞組成復雜以及功能狀態(tài)的不斷變化,測定單個細胞因子難以反映體內(nèi)免疫細胞的整體功能,因而快速、微量、多種細胞因子同時測定的方法才能保證我們對任何一個患者都可以獲得足夠的細胞因子信息用以進行對比分析。由

3、Luminex公司開發(fā)的液態(tài)懸浮芯片技術(shù)可以快速、微量、敏感地檢測數(shù)十種細胞因子,是ELISA方法的替代產(chǎn)品。這一技術(shù)使得對檢測樣本進行大規(guī)模定量分析成為可能。該技術(shù)獲得2005年臨床診斷領(lǐng)域技術(shù)革新頭獎。而且Bio-rad公司對該技術(shù)進行了進一步改進,如增加標準校正板,專用數(shù)據(jù)分析軟件等,大大提高了檢測范圍、靈敏度(從0.2pg到3200pg)和可靠性。同時該技術(shù)還開發(fā)出一種隨意組合技術(shù)(xplex)即檢測者可以依據(jù)自己檢測的需要對檢

4、測抗體進行組合,從而檢測自己所需要的細胞因子。
　　 我們在前人研究探索的基礎(chǔ)上提出了應用合適的免疫刺激劑活化外周全血免疫細胞,分析細胞因子的分泌情況,判斷患者免疫狀態(tài),以下是我們對該方法探索過程的總結(jié)。
　　 一 細胞因子譜評估免疫狀態(tài)所需參數(shù)的摸索
　　 能夠刺激外周全血分泌細胞因子的刺激劑較多,其中有絲分裂原(如PHA,ConA等)刺激能力較強,可以使免疫細胞較為充分的活化。我們比較了常見免疫刺激劑及其組合

5、對外周全血刺激的效果,發(fā)現(xiàn)在相同的濃度下PHA刺激組大多數(shù)細胞因子濃度快速上升,并且高于其它免疫刺激劑或刺激劑組合組,因此,我們選擇PHA作為本研究的刺激劑。不同的PHA濃度刺激效果存在差異,但隨著PHA濃度的增大細胞因子濃度的增高潛力逐漸減小,因此,我們推測PHA刺激外周全血存在一個最佳濃度,即達到此濃度后繼續(xù)增加PHA劑量,細胞因子的分泌不會相應增加,我們通過比較不同濃度PHA刺激外周全血的效果,發(fā)現(xiàn)10μg/ml的PHA刺激后細胞

6、因子濃度上升最快,濃度最高,因此,我們將10 μ g/ml作為本研究PHA的刺激濃度。PHA刺激外周血后細胞因子的濃度會逐漸上升,由于細胞的增殖需要消耗部分細胞因子,因此,細胞因子的分泌和消耗,應該在刺激一定時間后達到動態(tài)平衡,我們比較了PHA刺激3h、6h、9h和12h的細胞因子分泌情況,盡管細胞因子濃度的變化各有特色,但大多數(shù)細胞因子在PHA刺激后6-12小時濃度達到峰值或平臺值,此時,細胞因子的濃度相對穩(wěn)定,因此,我們選擇12小時

7、為本研究的最佳刺激時間。此外,為了明確非稀釋全血中的營養(yǎng)物質(zhì)能否滿足12小時培養(yǎng)的需要,我們還進行了外周血培養(yǎng)后PBMCs(外周血單個核細胞)活力的檢測,將非稀釋的外周全血培養(yǎng)13小時后分離PBMCs,進行流式檢測,發(fā)現(xiàn)PBMCs的存活率在90％以上,并且,刺激組和非刺激組結(jié)果一致。通過逐步摸索,我們確定將PHA作為本研究的免疫刺激劑,lOμg/ml作為本研究的PHA刺激濃度,12小時作為本研究的刺激時間。
　　 二 免疫抑制劑

8、對細胞因子譜的影響
　　 臨床常用免疫抑制劑主有神經(jīng)鈣蛋白抑制劑(如環(huán)孢素A和FK506)、驍悉、糖皮質(zhì)激素(如甲強龍和強的松)等。不同免疫抑制劑的作用機制各不相同,它們作用于外周全血后對細胞因子分泌的影響也必定有所不同,為了明確這些常用免疫抑制劑對細胞因子分泌的影響,我們選取了FK506、MPA(驍悉的有效成分)和地塞米松(按照強的松和甲強龍的作用效能比換算)作為免疫抑制劑的代表,并選取臨床常用濃度進行體外實驗。分別將上述免疫

9、抑制劑和PHA同時加入外周全血,培養(yǎng)12小時,檢測全血中細胞因子的分泌情況,發(fā)現(xiàn)三種免疫抑制劑均可影響細胞因子的分泌,但受影響的細胞因子譜不同,地塞米松抑制譜較寬,可以顯著抑制大多數(shù)細胞因子的分泌,包括IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-17、IL-5、IL-10、IL-13、IL-1β和G-CSF(P值均小于0.05)。FK506抑制譜較窄,僅能抑制IL-2和IL-13的分泌(P值均小于O.05)。MPA抑制譜和FK506

10、相同,僅能抑制IL-2和IL-13(P值均小于0.05),但MPA可以顯著增加IL-1β的分泌(P<0.05),這是MPA所特有的,是驍悉作用的因子標識。由此可見,免疫抑制劑可以影響細胞因子的分泌,并且具有特征性因子譜。
　　 不同劑量的免疫抑制劑可以造成機體不同的免疫狀態(tài),據(jù)此,我們推測不同濃度的免疫抑制劑對細胞因子分泌的影響程度也應該不同,或者具有濃度依賴性,為了明確此推測,我們選擇DEX(地塞米松)、FK506和MPA分析

11、免疫抑制劑對細胞因子的作用是否具有濃度依賴性,我們將抑制劑濃度分為四個梯度作用于外周全血,與PHA同時加入外周全血,培養(yǎng)12小時,觀察細胞因子的分泌情況,我們發(fā)現(xiàn)三種免疫抑制劑對細胞因子的作用均有濃度依賴性特點。因此,細胞因子檢測可以反映免疫抑制劑造成的不同免疫狀態(tài)。
　　 免疫抑制劑下調(diào)機體的免疫功能具有個體特異性,這種現(xiàn)象在臨床較為常見,相同血藥濃度的患者一些出現(xiàn)感染,而另外一些出現(xiàn)排斥反應,這是免疫抑制劑作用的個體差異所致

12、。免疫抑制劑作用外周全血后對細胞因子分泌的影響是否也有個體差異性,以及在同一個體重復同樣的操作所得結(jié)果是否可靠也不明確,為了了解個體間差異和和方法的可靠性,我們首先選擇了地塞米松進行實驗,發(fā)現(xiàn)DEX(地塞米松)對IL-5、IL-10和IL-13的抑制作用在3個健康志愿者之間存在差異(P值均小于0.05),在三名志愿者之間12種細胞因子的總體變異系數(shù)是23.95％±10.87％；在三次重復實驗中DEX對細胞因子的抑制作用沒有差異(P值均大

13、于O.05),在三次重復實驗中12種細胞因子的總體變異系數(shù)是16.05％±10.84％。由此可見,該檢測方法是可靠的,不同個體的外周全血對同種免疫抑制劑的反應是存在差異的。
　　 由于機體免疫系統(tǒng)的復雜性,臨床常采取多種免疫抑制劑聯(lián)合應用的方案進行抗排斥治療,因此,了解多種免疫抑制劑聯(lián)合作用對外周血細胞因子分泌的影響顯得很有必要。為了明確細胞因子的分泌能否反映多種免疫抑制劑的作用,我們選取了FK506+DEX、FK506+MPA

14、以及FK506+DEX+MPA三種聯(lián)合方案,分別將相應的免疫抑制劑和PHA同時加入外周全血,培養(yǎng)12小時,觀察外周血細胞因子的分泌情況。我們發(fā)現(xiàn)多藥聯(lián)合后其作用可以保留單一藥物的作用特點,并具有累加效應。含有DEX的組合可以抑制大多數(shù)細胞因子(P值均小于O.05),含有MPA的組合可以顯著增加IL-1β的分泌(P　　 三 腎移植受者術(shù)后細胞因子譜的變化
　　

15、 檢測健康人細胞因子的體外實驗表明該方法可以反映免疫抑制劑作用后的免疫細胞的功能狀態(tài),提示通過此方法可以評估器官移植患者術(shù)后機體的免疫狀態(tài)。器官移植患者由于服用多種免疫抑制劑,并且體內(nèi)長期帶有同種異體抗原,因此,體內(nèi)情況更為復雜,細胞因子能否反映臨床患者的真實免疫狀態(tài)尚難確定。為了明確此方法能否反映臨床患者的免疫狀態(tài)變化,我們精心挑選了兩例典型的腎移植患者進行對比觀察,對細胞因子譜評估免疫狀態(tài)的方法進行初步檢驗。兩例患者中一例是二次移植

16、,PRA陽性,另一例是初次移植,PRA陰性,供腎來自同一供者。二次移植患者術(shù)后出現(xiàn)了排斥反應,再次出現(xiàn)肌酐升高和尿量減少；初次移植患者術(shù)后恢復良好,腎功能迅速恢復正常。二次移植患者在排斥反應指征出現(xiàn)之前細胞因子分泌明顯高于初次移植患者,并且細胞因子的變化同臨床指征變化具有一致性。我們檢測了17種細胞因子,發(fā)現(xiàn)IL-2,IL-4,IL-6,GM-CSF,IFN-γ,TNF-α的變化規(guī)律與排斥患者的臨床狀況的改變一致,并且比臨床癥狀更敏感和

17、有更好的時間優(yōu)勢；腎功能穩(wěn)定患者的多數(shù)細胞因子濃度一直保持在較低水平,其血藥濃度檢測也顯示濃度過高,兩者具有一定的相關(guān)性。由此可見,細胞因子檢測評估腎移植受者機體免疫狀態(tài)是可行的。為了進一步評估和優(yōu)化該方法,還需要收集更多患者的臨床樣本,動態(tài)觀察細胞因子的分泌,通過多參數(shù)統(tǒng)計分析準確判斷機體的免疫狀態(tài)。
　　 本研究的主要創(chuàng)新點
　　 1.目前,在世界范圍內(nèi)尚無確切可靠的方法來判斷患者的免疫狀態(tài),該項目的研究將填補此方面

18、的空白,面向臨床,服務患者。
　　 2.抓住器官移植受者免疫狀態(tài)這一主要矛盾,瞄準免疫細胞活化這一關(guān)鍵環(huán)節(jié),通過測定移植受者免疫細胞活化能力來判斷免疫系統(tǒng)功能,進而為臨床合理應用免疫抑制劑提供可靠數(shù)據(jù)。
　　 3.采用全血檢測,最大程度地保持了體內(nèi)復雜的環(huán)境,同時縮短檢測時間,滿足了臨床快速檢測的要求,適于推廣應用。
　　 4.采用多細胞因子整體分析,綜合評估,更能反映體內(nèi)細胞因子相互作用網(wǎng)絡的真實情況,更具有代