KLF2調(diào)控CXCR1、CXCR2、L-selectin、CD11a等對類中性粒細(xì)胞粘附遷移的作用機(jī)制.pdf

1、背景及目的：支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，中性粒細(xì)胞是支氣管哮喘氣道炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，中性粒細(xì)胞在支氣管內(nèi)聚集是嚴(yán)重類型哮喘的共同特征，但支氣管內(nèi)中性粒細(xì)胞增多的機(jī)制并不清楚。本研究主要從細(xì)胞水平去闡述KLF2是否通過調(diào)節(jié)CXCR1、CXCR2、L-selectin、CD11a、CD11b、CD18的表達(dá)來影響類中性粒細(xì)胞粘附遷移過程。
　　研究方法：
　?。?）培養(yǎng)HL-60細(xì)胞，DMSO誘導(dǎo)分化為類中性粒細(xì)胞

2、，通過Diff染色觀察細(xì)胞核形態(tài)及Realtime-PCR檢測中性粒細(xì)胞分化標(biāo)志物CD11b mRNA的表達(dá)，確定是否誘導(dǎo)成功
　?。?）用空載及KLF2-RNAi慢病毒載體轉(zhuǎn)染類中性粒細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、空載組和siRNA干預(yù)組。應(yīng)用熒光顯微鏡、Western blot法進(jìn)行轉(zhuǎn)染鑒定。
　?。?）Realtime PCR檢測三組中CXCR1、CXCR2、L-selectin、CD11a、CD11b、CD18 mRNA的表

3、達(dá)，Western blot檢測三組中CXCR1、CXCR2、L-selectin的蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11a、CD11b、CD18平均熒光強(qiáng)度。
　?。?）熒光顯微鏡觀察三組中標(biāo)記有calcein-AM的類中性粒細(xì)胞對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附情況及應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)計數(shù)濃度為10 ng/ ml的IL-8對三組類中性粒細(xì)胞的趨化遷移率。
　　結(jié)果：
　　1. 類中性粒細(xì)胞的鑒定
　　CD11b為公認(rèn)的中

4、性粒細(xì)胞分化成熟標(biāo)志之一，HL60細(xì)胞在經(jīng)1.3％DMSO誘導(dǎo)后，通過Realtime-PCR檢測其CD11b mRNA表達(dá)量并與未經(jīng)過誘導(dǎo)的HL60細(xì)胞相比較，誘導(dǎo)后呈明顯增多（P<0.01），Diff染色油鏡下觀察類中性粒細(xì)胞核呈現(xiàn)腎型及雙葉。
　　2. KLF2的干擾
　　熒光顯微鏡觀察帶有GFP的慢病毒熒光轉(zhuǎn)染效果，計算感染效率達(dá)到90%以上；Westernblot檢測KLF2蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)干擾組的表達(dá)與其他兩組比較

5、明顯減少（P<0.01），而空白組與空載組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，計算其敲除率約為76%。
　　3. mRNA及蛋白的檢測
　?。?）Realtime PCR結(jié)果顯示：KLF2干擾組與空白組、空載組相比較，CXCR1、CXCR2、CD11a、CD11b、CD18 mRNA的表達(dá)呈明顯增多，而L-selectin mRNA的表達(dá)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；而以上因子空白組與空載組相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

6、r>　　(2) Western blot結(jié)果顯示：KLF2干擾組與空白組、空載組相比較，CXCR1、CXCR2蛋白的表達(dá)明顯增多，而L-selectin蛋白的表達(dá)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；而以上因子空白組與空載組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示干擾組CD11a、CD11b、CD18的平均熒光強(qiáng)度與空白組，空載組相比較明顯增多（P<0.01）；而空白組與空載組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

7、
　　4. 類中性粒細(xì)胞的粘附及遷移實(shí)驗(yàn)
　?。?）熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示：KLF2干擾組鏡下的類中性粒細(xì)胞粘附數(shù)與空白組、空載組相比較呈明顯增多（P<0.05）；而空白組與空載組相比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。
　?。?）10 ng/ ml濃度的IL-8對類中性粒細(xì)胞遷移率，KLF2干擾組遷移率與空白組、空載組相比較呈明顯增多（P<0.01），而空白組與空載組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　（1）K