維甲酸受體激動劑AM80誘導造血干細胞分化形成的中性粒細胞的殺胞的殺菌功能及機制研究.pdf

1、研究目的:中性粒細胞減少癥是由于外周血中性粒細胞數(shù)量減少而出現(xiàn)的一組綜合征，是腫瘤治療中最常見的并具有潛在的致命性的并發(fā)癥。統(tǒng)計表明中性粒細胞減少癥在接受化療的實體腫瘤病人中發(fā)生率為10％-20％，院內(nèi)的死亡率達到9.8％。盡管重組粒細胞集落刺激因子(G-CSF)通過促進人造血干細胞的粒系分化而發(fā)揮較好的的預(yù)防中性粒細胞減少癥的作用，但是其治療作用并不明顯。因此，尋找高效的誘導造血干細胞分化為中性粒細胞的藥物是解決上述問題的關(guān)鍵。維甲酸

2、（RA）通過激活配體依賴性的轉(zhuǎn)錄激活因子RARα，促進白血病的原始粒細胞和造血干細胞的粒性分化。維甲酸類似物AM80是特異性的RARα受體激動劑，研究表明AM80的誘導早幼粒細胞白血病細胞分化能力大約是RA的10倍并且毒性較低。2005年AM80在日本上市用于復發(fā)性難治性的急性早幼粒細胞白血病的治療，但是AM80對造血干細胞分化的作用則未見報道。本文首先考察比較了AM80和G-CSF誘導造血干細胞分化的能力，其次比較AM80和G-CSF

3、誘導造血干細胞分化生成中性粒細胞的殺菌功能，最后對殺菌機制進行研究。本研究對于將AM80作為一種成本較低的治療藥物運用于中性粒細胞減少癥具有重要的指導意義。
　　方法和結(jié)果:我們首先考察了AM80，G-CSF以及其他的維甲酸受體激動劑對造血干細胞CD34+細胞的誘導分化作用。應(yīng)用吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)學改變，結(jié)果顯示AM80誘導產(chǎn)生的成熟粒細胞的比例明顯高于G-CSF，表明AM80誘導造血干細胞CD34+細胞分化的能力強于G-CS

4、F。臺盼藍拒染法和細胞計數(shù)結(jié)果顯示與G-CSF類似，AM80(2.5 nM)在促進CD34+細胞增殖的同時細胞的死亡率低于10％。我們進一步采用透射電鏡觀察G-CSF誘導生成的粒細胞(GIN)，AM80誘導生成的粒細胞(AIN)以及外周血中性粒細胞(PBN)的細胞超微結(jié)構(gòu)，圖片顯示AIN中的顆粒蛋白數(shù)量多于GIN。我們隨后檢測大腸桿菌(E.coli DH5α)刺激下GIN，AIN和PBN脫顆粒的能力。Western blotting結(jié)果

5、顯示細菌刺激下AIN產(chǎn)生并分泌的顆粒蛋白髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，乳鐵蛋白(lactoferrin)，人類內(nèi)源性抗菌肽(LL-37)，明膠酶(MMP-9)的水平均高于GIN。以上結(jié)果顯示AM80促進粒細胞分化和粒細胞顆粒蛋白產(chǎn)生的能力強于G-CSF，提示AM80誘導產(chǎn)生的高水平分化可能轉(zhuǎn)化為對抗細菌感染的免疫功能。為了證明這一假設(shè)，我們采用吞噬和殺傷細菌試驗評價GIN，AIN和PBN殺傷大腸桿菌和金黃色葡萄

6、球菌能力，結(jié)果顯示細胞與細菌共孵育一定時間后，AIN和PBN細胞外細菌數(shù)顯著低于GIN，細胞內(nèi)存活細菌數(shù)同樣低于GIN。基于以上數(shù)據(jù)計算細胞吞噬細菌數(shù)和殺死細菌的數(shù)量，結(jié)果顯示AIN吞噬和殺傷細菌的數(shù)量明顯高于GIN。同時我們采用LIVE/DEAD BacLight細菌活性測定試劑盒結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)細菌的存活狀態(tài)，結(jié)果表明GIN中的活菌數(shù)遠多于AIN和PBN，AIN和PBN中殺死的細菌數(shù)遠多于GIN。透射電鏡觀察細菌感染的

7、細胞同樣也顯示GIN中存在大量存活的細菌，而AIN和PBN中則沒有。以上結(jié)果均證實了AIN吞噬和殺傷細菌的能力強于GIN。為了深入研究AM80增強中性粒細胞的殺傷細菌功能的機制，我們采用流式細胞術(shù)考察GIN，AIN和PBN表面抗原CD18-CD66，CD11 b-CD66的共表達水平，檢測結(jié)果表明AIN細胞免疫抗原CD66a+CD18+和CD66b+CD18+的比例分別為40％和60％，而GIN細胞CD66a+CD18+和CD66b+C

8、D18+的比例則分別為13％和34.9％。同樣的，AIN細胞CD66a+CD11b+和CD66b+CD11b+的比例為40.9％和40％，GIN細胞則分別為20.2％和18％。以上數(shù)據(jù)結(jié)果顯示AIN細胞表面CD18-CD66和CD11b-CD66的表達水平高于GIN。這一結(jié)果提示AM80在促進造血干細胞分化的同時也促進了CD18-CD66信號網(wǎng)絡(luò)的完善從而殺傷細菌。為了證實這一想法，我們采用CD18抗體中和CD18功能阻斷CD66-CD

9、18信號通路檢測GIN，AIN和PBN的殺傷大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性，結(jié)果顯示加入CD18抗體后，AIN和PBN吞噬和殺傷細菌的能力顯著下降。提示CD18-CD66信號通路在AM80誘導的中性粒細胞免疫功能的增強中發(fā)揮的重要作用。我們進一步采用中性粒細胞減少癥小鼠模型考察G-CSF和AM80在體內(nèi)誘導分化的中性粒細胞的殺菌能力，實驗結(jié)果顯示盡管G-CSF能夠促進外周血中性粒細胞的大量產(chǎn)生，但是AM80在小鼠中動員的中性粒細胞吞噬和

10、殺傷細菌的能力強G-CSF。
　　結(jié)論:本論文首次研究了AM80誘導造血干細胞分化的中性粒細胞的殺菌功能并對其機制進行了初步的探討。AM80誘導粒細胞分化能力強于G-CSF，AIN在體外和中性粒細胞減少癥小鼠模型中殺菌活性與PBN或者MPBN類似并強于GIN，可能是由于CD66和CD18相互協(xié)同作用加強了中性粒細胞的免疫功能。這一研究將為AM80作為一種低成本的治療方法用于誘導造血干細胞粒性分化進而治療中性粒細胞減少癥提供了實驗依