蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管核因子-κB激活及調(diào)控的相關(guān)研究.pdf

1、自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH；下文SAH都特指自發(fā)性SAH)主要是由顱內(nèi)動脈瘤破裂引起,是臨床上較常見的致死、致殘性疾病,占所有中風(fēng)患者的5％左右,在普通人群中的發(fā)生率約為8/10萬人。盡管近年來診斷水平、麻醉技術(shù)、手術(shù)及圍手術(shù)期處理水平在不斷提高,但SAH的預(yù)后仍未得到明顯改觀,數(shù)據(jù)顯示SAH病人的死亡率在45％左右,而幸存者中大概三分之一左右生活不能自理,有較高的致殘率。而致死、致殘的

2、主要因為除了SAH起病急驟等自身特點之外,臨床上對其缺乏有效的治療方法和手段也是影響本病轉(zhuǎn)歸的主要因素,而治療手段的缺乏則要歸咎于目前對于SAH病理生理機制認識的局限性。
　　 腦血管痙攣被認為是SAH患者死亡和殘疾的主要因為。腦血管痙攣主要發(fā)生于破裂動脈瘤周圍的大血管,可導(dǎo)致嚴重的、多灶性的腦缺血,從而造成不良的臨床轉(zhuǎn)歸。雖然對腦血管痙攣的臨床及基礎(chǔ)研究很多,但至今腦血管痙攣仍是一種缺乏有效治療的嚴重病理狀態(tài)。
　　

3、越來越多的證據(jù)表明炎性反應(yīng)是造成腦血管痙攣的一個重要機制,臨床和實驗研究都發(fā)現(xiàn)SAH后腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)及血清中細胞因子(cytokines)及內(nèi)皮細胞粘附分子(endothelial adhesion molecules)水平明顯升高。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)的快轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB家族包括p50、RelA/p65、c-Rel、RelB和p5

4、2這5個亞單位,他們之間再組成二聚體以實現(xiàn)其功能。在靜息狀態(tài)下NF-κB位于細胞漿內(nèi),與其抑制蛋白IκB保持結(jié)合狀態(tài)。NF-κB一旦被激活,就與IκB分離并轉(zhuǎn)位入核,可以調(diào)控細胞因子、趨化分子(chemokines)和粘附分子等在炎性分子的轉(zhuǎn)錄。因此,很多與炎性相關(guān)的疾病都與NF-κB密切相關(guān)?，F(xiàn)已證實,NF-κB在腦缺血(cerebral ischemia)及創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury)中起著非常重要的

5、作用。因此,可以推斷NF-κB在腦血管痙攣的發(fā)生、發(fā)展中或有著重要的作用,它可通過炎性反應(yīng)引起腦血管痙攣或影響腦血管痙攣的程度,NF-κB或許是腦血管痙攣治療中的一個潛在靶點。事實上,在SAH動物實驗中已經(jīng)證明NF-κB激活后通過調(diào)控炎性反應(yīng)機制引起腦血管痙攣。但是在腦血管痙攣發(fā)生中起著極為重要作用的平滑肌細胞內(nèi),導(dǎo)致血管痙攣的氧合血紅蛋白(oxyhemoglobin)對NF-κB的激活情況目前尚無系統(tǒng)研究,本研究的主要目的之一就是在體

6、外探討不同濃度氧合血紅蛋白對培養(yǎng)的血管平滑肌細胞(vascular smooth musclecells)內(nèi)NF-κB激活的影響,以進一步揭示腦血管痙攣與平滑肌細胞內(nèi)NF-κB關(guān)系的確切機制。
　　 此外,動物實驗和臨床研究均發(fā)現(xiàn)紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)可以有效的緩解腦血管痙攣,從而改善SAH患者的預(yù)后,但是對其治療機制的認識,目前還非常有限。因此本研究結(jié)合前面的研究,對EPO治療腦血管痙攣的作用再次

7、在兔二次注血SAH模型中證實的前提下,通過觀察其對NF-κB的調(diào)控作用,來闡明EPO對腦血管痙攣治療的機制。
　　 因此,本研究主要是通過體外研究,證實氧合血紅蛋白可激活培養(yǎng)的腦血管平滑肌細胞中的NF-κB這一假說。在此基礎(chǔ)上,進一步研究目前臨床上證實對腦血管痙攣有較好治療作用的EPO對SAH后血管內(nèi)NF-κB活性的調(diào)控以及與其治療作用之間的關(guān)系。由此,也更進一步證實了NF-κB在腦血管痙攣中的重要作用。
　　 第一部分

8、 不同濃度氧合血紅蛋白對體外培養(yǎng)腦血管平滑肌細胞NF-κB DNA結(jié)合活性的影響
　　 目的:通過體外實驗,觀察氧合血紅蛋白對培養(yǎng)的腦血管平滑肌細胞密度及NF-κB激活的影響,以證實氧合血紅蛋白可通過影響腦血管平滑肌細胞的形態(tài)并激活NF-κB而最終引起腦血管痙攣。
　　 方法:取兔基底動脈進行腦血管平滑肌細胞的原代培養(yǎng)并用α-actin的免疫組化進行平滑肌細胞鑒定。取該動物的自身的血液制作氧合血紅蛋白。用不同濃度(1 μ

9、mol/L-100 μmol/L)的氧合血紅蛋白處理培養(yǎng)的腦血管平滑肌細胞,觀察其形態(tài)學(xué)及細胞密度變化,并通過測定NF-κB的DNA結(jié)合活性(凝膠電泳遷移分析法)評估NF-κB的激活情況。
　　 結(jié)果:氧合血紅蛋白刺激后腦血管平滑肌細胞都表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)的改變,主要表現(xiàn)為貼壁率下降,細胞壞死脫落增加,細胞分布較稀疏,部分細胞懸浮于培養(yǎng)液中,且隨氧合血紅蛋白濃度的增加而愈加嚴重。但是在24小時時只有100μmol/L,組有明顯的細胞數(shù)

10、量減少(與對照組比較P<0.05),10μmol/L組在48小時時細胞數(shù)量開始明顯較少(與對照組比較P<0.05)。平滑肌細胞的NF-κB的DNA結(jié)合活性在經(jīng)氧合血紅蛋白處理后(>10μmol/L)明顯增高(與對照組比較P<0.05),不呈劑量依賴性,以10μmol/L及50μmol/L組為最高(與對照組相比P<0.01)。
　　 結(jié)論:NF-κB的DNA結(jié)合活性在經(jīng)氧合血紅蛋白處理的腦血管平滑肌細胞中有明顯改變,證明了腦血管痙

11、攣的主要致痙攣源氧合血紅蛋白可以激活平滑肌細胞內(nèi)的NF-κB,同時提示了NF-κB在CVS發(fā)生時是腦血管平滑肌細胞內(nèi)重要的信號通路。
　　 第二部分 EPO治療兔SAH后腦血管痙攣及對腦血管NF-κB調(diào)控的實驗研究
　　 目的:在兔SAH模型中驗證EPO對遲發(fā)性腦血管痙攣的療效,同時觀察其對腦血管NF-κB激活情況的影響。
　　 方法 取雄性新西蘭白兔60只,隨機分為對照組、SAH組和EPO治療組,每組20只(n

12、=20)。采用枕大池二次注血SAH模型誘發(fā)遲發(fā)性腦血管痙攣。EPO注射劑量為1000IU/kg,1次/8小時；對照組和SAH組均給予EPO的溶劑(含人血清蛋白2.5 mg/ml、氯化鈉352mmol/L及蒸餾水),以1ml/kg經(jīng)腹腔注射,連續(xù)腹腔注射15次。造模后第5天處死動物,取基底動脈,HE染色后測定基底動脈管腔橫截面積,并用凝膠電泳遷移分析法檢測NF-κB活性。
　　 結(jié)果 ①對照組、SAH組和EPO治療組兔的基底動脈管

13、腔截面積分別為(0.420±0.008)mm2、(0.225±0.025)mm2和(0.353±0.085)mm2。SAH組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明模型制作成功、有效；EPO治療組與SAH組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明EPO治療可以緩解腦血管痙攣程度；EPO治療組與對照組比較,仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明EPO治療并不能完全緩解腦血管痙攣,EPO并不能對抗引起腦血管痙攣的全部機制,或者能夠?qū)@些

14、機制都能完全逆轉(zhuǎn)。②對照組、SAH組和EPO治療組的NF-κB活性灰度值分別為:1.180±0.079、9.350±0.691和6.220±0.583,SAH組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),再次表明SAH后腦血管NF-κB被激活；EPO治療組與對照組、SAH組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),這說明了EPO可以抑制腦血管NF-κB的激活、調(diào)控其表達,但是因其并非NF-κB的特異性抑制劑,EPO并不能完全抑制SAH后N

15、F-κB的激活。
　　 結(jié)論 腦血管內(nèi)的NF-κB在兔二次注血SAH模型中被激活；一定劑量的EPO治療(1000IU/kg)可以部分抑制SAH后NF-κB的激活,并能通過調(diào)控該NF-κB的激活,從而緩解SAH后的遲發(fā)性腦血管痙攣。
　　 通過這兩部分研究,首次系統(tǒng)的證實了作為主要致痙攣源的氧合血紅蛋白,可以引起腦血管平滑肌細胞中表征NF-κB活性的NF-κB的DNA結(jié)合活性增高。表示氧合血紅蛋白可以激活平滑肌細胞內(nèi)的NF

16、-κB,使其活性增高。而通過EPO在動物SAH模型內(nèi)下調(diào)SAH后的NF-κB活性后發(fā)現(xiàn)腦血管痙攣也能明顯減輕,這也進一步證實了NF-κB在腦血管痙攣中的作用,同時也再次證實了EPO對腦血管痙攣的治療作用,從炎性反應(yīng)及其上游調(diào)控因子NF-κB這一方面揭示了EPO治療腦血管痙攣的機制。這將為今后在體外平滑肌細胞中研究氧合血紅蛋白通過影響何種方式、何種因子激活NF-κB從而引起腦血管痙攣以及EPO通過那種具體的方式抑制NF-κB從而減輕腦血管