表達ESAT-6-gpi和IL-21的B16F10瘤苗誘發(fā)抗腫瘤效應與機制研究.pdf

1、腫瘤基因工程疫苗是在研的常用腫瘤疫苗形式之一,其能通過基因工程技術,將不同的目的基因,如細胞因子、輔助刺激分子、主要組織相容性復合體-Ⅰ(MHC-Ⅰ)類分子等導入腫瘤細胞,接種后改變局部微環(huán)境,增強抗原提呈細胞(A-PC)和腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)活性,解決了傳統(tǒng)腫瘤細胞疫苗免疫原性弱,難以誘導有效的抗腫瘤免疫應答的弊端。惡性黑色素瘤早期即易發(fā)生轉移,手術治療效果不理想,對常規(guī)化療、放療也不敏感,但由于其具有免疫原性,可進行

2、免疫治療。本研究向小鼠黑色素瘤B16F10細胞內(nèi)導入白細胞介素-21(IL-21)和糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)修飾的6kD結核桿菌早期分泌靶抗原(6kD early secretary antigenic target,ESAT-6)基因制成小鼠黑色素瘤瘤苗,膜表達“人工標記異種抗原”ESAT-6,并在接種部位分泌表達IL-21,誘導機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應答。具有強免疫原性的E

3、SAT-6借助GPI錨定表達于瘤苗細胞表面,刺激機體產(chǎn)生的抗體通過補體介導的細胞毒作用(CDC)和抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)作用殺傷瘤苗,釋放抗原物質(zhì)和凋亡的瘤苗促進樹突狀細胞(DC)對腫瘤抗原的攝取和提呈,打破機體對原發(fā)腫瘤的免疫耐受,誘導產(chǎn)生細胞毒T淋巴細胞(CTL)腫瘤特異性免疫應答,通過細胞毒作用殺傷表達ESAT-6的瘤苗細胞。ESAT-6只存在于瘤苗細胞,當瘤苗被清除后,ESAT-6的作用即停止,其副作用較小,

4、而此時抗腫瘤免疫應答已經(jīng)通過ESAT-6的引導作用而建立起來。瘤苗分泌的IL-21可增強荷瘤鼠CTL、自然殺傷細胞(NK)細胞等抗腫瘤活性。瘤苗膜表達的ESAT-6和分泌表達的IL-21分別以不同機制共同發(fā)揮誘導抗腫瘤免疫應答作用。
　　 目的:研制膜表達ESAT-6-gpi、分泌表達IL-21的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗,評估其誘導的抗腫瘤免疫效應,并分析其作用機制。
　　 方法與內(nèi)容:

5、　　 1.構建plRES-.ESAT-6-gpi/IL-21重組質(zhì)粒,用其轉染B16F10細胞,G418加壓培養(yǎng),應用單克隆和RT-PCR方法篩選出穩(wěn)定轉染的單克隆細胞株,檢測其ESAT-6和IL-21的表達及其功能,合格的單克隆細胞做為瘤苗。
　　 2.應用米托蒽醌(MIT)處理B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗,確保瘤苗應用的安全性和有效性。以pIRES-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫小鼠,檢測pIRES

6、-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫對B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗協(xié)同抗腫瘤免疫效應及分析其效應機制。
　　 3.通過小鼠致瘤實驗評估B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗的安全應用劑量。用B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗免疫小鼠,評價其誘導的體液和細胞免疫功能,觀察其誘導的抗腫瘤免疫效應,并通過檢測活瘤苗免疫對腫瘤細胞上皮.間質(zhì)轉化(EMT)的影響,分析其抗腫瘤機制。

7、>　　 結果:
　　 1.經(jīng)過雙酶切和DNA測序鑒定,成功構建了pIRES-ESAT-6-gpi和pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21兩個重組質(zhì)粒,分別轉染B16F10細胞后,篩選出了穩(wěn)定轉染的B16F10-ESAT-6-gpi和B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21單克隆細胞株,以能正確表達ESAT-6-gpi和IL-21且具有生物活性的克隆,做為實驗用瘤苗。
　　 2.MIT可安全滅活B16F10-

8、ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗,使其停止增殖,短期內(nèi)仍保持活力,表達IL-21,增強瘤苗免疫原性。瘤苗細胞凋亡后,膜表面的ESAT-6呈點簇狀分布。pIRES-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫血清能夠增強DC對膜表達ESAT-6瘤苗的攝取,并促進DC的成熟。plRES-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫可協(xié)同B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗誘導產(chǎn)生更強的針對野生型B16F10細胞的體液和細胞免疫反應,實驗小鼠腫瘤生

9、長減慢,生存期延長。
　　 3.以2×105個B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗免疫接種14只C57BL/6小鼠,60天內(nèi)沒有可見的腫瘤生長,具有可靠的安全性,并能拮抗B16F10細胞攻擊,使腫瘤生長明顯受到抑制,生長緩慢,生存期延長。B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗免疫誘導小鼠產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應答,體現(xiàn)在血清抗ESAT-6抗體和IFN-γ水平增高,CDC活性增強,脾臟和淋巴結CD8+淋

10、巴細胞比例上升,CTL和NK細胞活性明顯增強。B16F10-ESAT-6-gpi-IL-21活瘤苗免疫還能使免疫鼠肺部腫瘤結節(jié)數(shù)量減少,致使荷瘤鼠黑色素瘤TGF-β1產(chǎn)生減少,促進miR-200c轉錄表達及下調(diào)ZEB1蛋白表達,從而防止免疫鼠黑色素瘤發(fā)生EMT,使其轉移能力減弱。
　　 結論:
　　 膜表達ESAT-6-gpi和分泌表達IL-21的B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗的致瘤能力下降,安全性和