

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文檔簡介
1、子癇前期(preeclampsia)伴有全身多臟器的損害,嚴重患者可因產(chǎn)后出血、腦出血、心功能衰竭、肺水腫、彌漫性血管內(nèi)出血而死亡,引起胎兒宮內(nèi)生長受限和早產(chǎn)。在世界范圍內(nèi)大約10%妊娠婦女血壓升高,2%-8%妊娠婦女合并子癇前期,10%-15%孕產(chǎn)婦直接死亡原因和子癇前期、子癇有關。
關于子癇前期的發(fā)病機制存在很多學說卻無統(tǒng)一定論。近年大量研究證據(jù)支持這樣一個病因假說,即母體血管系統(tǒng)和早期胎盤不相容,免疫介導的滋養(yǎng)細胞侵
2、蝕胎盤螺旋動脈,導致胎盤淺著床,血流灌注不足和缺氧,使得胎盤分泌一些毒性因子(如激素和代謝小分子)進入母體循環(huán),從而活化血管內(nèi)皮,導致血管內(nèi)皮細胞功能的廣泛改變和全身系統(tǒng)血管收縮,出現(xiàn)子癇前期臨床癥狀。目前已知的與疾病發(fā)生相關的循環(huán)因子包括血管內(nèi)皮生長因子、胎盤生長因子等,有學者對這些因子預測妊娠期高血壓疾病發(fā)病的能力進行研究,遺憾的是這些已知的循環(huán)因子并不能很好的預測疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此近年來人們希望通過組學技術尋找和發(fā)現(xiàn)循環(huán)中生物
3、標記物,來預測疾病發(fā)生,判定疾病發(fā)展程度,盡早的給予合理預防和目標靶向治療,這對于臨床診斷和治療子癇前期、降低孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡率具有重要意義。
代謝組學是組學技術的一種,可以概括為應用高通量、高分辨、高靈敏度的分析手段,定性定量研究生物體體液中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物即代謝組,結合模式識別等化學信息學技術,分析生物體在不同狀態(tài)下的代謝指紋圖譜的差異,獲得相應的生物標志物群,跟蹤其代謝路徑,從而揭示生物體在特定時間、環(huán)境下的整體功
4、能狀態(tài)。鑒于代謝組學技術可以獲得生物標記物群,預測疾病發(fā)生,判定疾病發(fā)展程度,進行目標靶向治療,英國學者利用基于氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的代謝組學技術研究子癇前期患者血漿代謝輪廓,分析代謝圖譜的差異尋找代謝生物標記物群檢測子癇前期,這個研究初步將代謝組學的研究方法應用于子癇前期,但是由于該實驗選擇氣相色譜為分析分離手段,前期預處理過程較復雜,重復性低,花費時間較長,可能造成代謝產(chǎn)物丟失,且沒有提供代謝生物標記物的結構信息,其生物標記物檢測子癇前
5、期的敏感性和特異性有待提高。
本課題選擇基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜為分析分離手段的代謝組學技術,結合化學信息學技術,檢測重度子癇前期患者的血漿代謝輪廓,并進一步分析以氨基酸為目標的代謝指紋,尋找代謝生物標記群,希望找到一個有效的生物標記物,能夠簡單、快速的判定疾病發(fā)展的程度,在疾病發(fā)生早期即給予合理干預和靶向治療,延緩疾病的發(fā)生發(fā)展,監(jiān)測疾病的治療效果,降低子癇前期的發(fā)生率,改善母兒預后。
第一章重度子癇前期患者的
6、血漿代謝組學分析
[目的]
本研究采用基于HPLC/MS/MS-QTrap的代謝組學方法對重度子癇前期婦女和正常妊娠婦女血漿代謝組分進行檢測、分析,旨在了解重度子癇前期的代謝輪廓,結合模式識別化學信息學技術,對比差異代謝產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)生物標記物群,嘗試鑒定重度子癇前期的代謝生物標記物,在疾病發(fā)生早期即給予合理干預和靶向治療,延緩疾病的發(fā)生發(fā)展,監(jiān)測疾病的治療效果,為進一步研究其發(fā)病機制開辟新思路。
7、[方法]
1、標本來源:選取2010年6月~11月在南方醫(yī)科大學附屬深圳市婦幼保健院產(chǎn)科住院分娩的重度予癇前期孕婦51例為重度子癇前期組。另選取同期定期產(chǎn)檢,排除妊娠期合并癥和并發(fā)癥,單胎懷孕至足月,產(chǎn)后追蹤胎兒無畸形的正常妊娠婦女45例(正常妊娠組)做為對照。研究對象入院后,立即抽取肘靜脈血3ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)。輕顛倒抗凝管5次,使用冷凍離心機,4℃以1500轉離心15分鐘,取血漿置于-80℃冰箱保
8、存待測。
2、樣品預處理:血漿室溫解凍后,吸取100μl置離心管中,加入300μl甲醇沉淀蛋白,渦旋混勻1分鐘,使用冷凍高速離心機,4℃離心15分鐘,12000轉。取上清液經(jīng)針頭式過濾器過濾后分析。
3、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)分析:分別設置液相色譜、質(zhì)譜條件及其工作模式,自動加樣。
4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法:原始的LC-MS數(shù)據(jù)文件,導入the MarkerViewTM軟件進行數(shù)據(jù)的提取及
9、前處理,采用主成分分析(PCA)觀察各組樣本間的總體分布狀況。然后用主成分判別分析法(PCA-DA)鑒別對各組間代謝輪廓差異貢獻較大的代謝物,找到與重度子癇前期最相關的差異代謝物。在MarkerViewTM軟件包中對相關的差異代謝物行t檢驗。
[結果]
1、應用HPLC/MS/MS-QTrap進行檢測,得到重度子癇前期組和正常妊娠組血漿的代謝物總離子流色譜(total ion chromatogram,TIC
10、)對比圖。重度子癇前期組和正常妊娠組的血漿代謝物總離子流色譜圖有差別。
2、應用HPLC/MS/MS-QTrap進行分離和檢測出九百多個代謝分子,得到代謝輪廓。51例重度子癇前期患者和45例正常妊娠婦女經(jīng)代謝組學方法得到很好的區(qū)分,并找到相對應的16個潛在生物標記物,其中濃度呈下降趨勢的代謝小分子有峰89、95、98、118、135、157、187、191、215、240,濃度呈上升趨勢的有峰139、155、284、451
11、、837、922。
[結論]
建立的基于HPLC/MS/MS-QTrap代謝組學方法可以區(qū)分重度子癇前期和正常妊娠,表明該方法適合于重度子癇前期的代謝組學研究。找到相對應的16個潛在的生物標記物,并對有差異的代謝物進行增強型全掃描(EMS)及增強性子離子掃描(EPI),提供了大量代謝物結構上的信息,將來可以進一步鑒定代謝物名稱并對其深入研究。綜合代謝標記物變化趨勢構成重度子癇前期的代謝特征,其對早期診斷重度子
12、癇前期有很好的前景。
第二章重度子癇前期血漿氨基酸代謝輪廓分析
[目的]
本研究采用基于HPLC/MS/MS-QTrap的代謝組學方法分析重度子癇前期婦女和正常妊娠婦女氨基酸代謝指紋,建立基于HPLC/MS/MS-QTrap技術的血漿氨基酸代謝指紋方法。探討重度子癇前期氨基酸代謝輪廓,為進一步研究氨基酸代謝在重度子癇前期發(fā)病代謝通路提供線索。
[方法]
1、標本來源:
13、選取重度子癇前期婦女13例為重度子癇前期組,正常妊娠婦女10例做為對照。
2、樣品預處理:待檢血漿室溫解凍后,吸取100μl置離心管中,加入300μl甲醇沉淀蛋白,渦旋混勻1分鐘,使用冷凍高速離心機,在4℃以12000轉離心15分鐘。取上清液經(jīng)針頭式過濾器過濾,過濾后取50μl置于96孔過濾板中,每孔加入含氨基酸同位素內(nèi)標的甲醇100μl,室溫放置20分鐘,萃取血片中的氨基酸,然后離心至另一個96孔聚丙烯板,50℃加熱吹干
14、,再加入60μl鹽酸正丁醇(3mol/L),Teflon膜覆蓋,置65℃恒溫箱內(nèi)15分鐘,隨后50℃加熱吹干,再加入80%乙腈100μl溶解,鋁膜覆蓋,即可上樣檢測。
3、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)分析:分別設置液相色譜、質(zhì)譜條件及其工作模式,自動加樣。
4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法:定量分析采用軟件ChemoView1.2版本(美國生物應用系統(tǒng)公司),根據(jù)同位素內(nèi)標和各種丁酯化的氨基酸離子峰強度,由已知濃度的
15、內(nèi)標,自動計算出所測樣品中氨基酸的濃度。統(tǒng)計用SPSS13.0軟件,得到濃度結果數(shù)據(jù)以(x)士S表示,經(jīng)方差齊性檢驗后,若方差齊則采用兩獨立樣本的t檢驗;若方差不齊則采用近似t檢驗,P<0.05時有統(tǒng)計學意義。
[結果]
1、本實驗應用HPLC/MS/MS-QTrap進行檢測,成功得到重度子癇前期組和正常妊娠組血漿的氨基酸代謝指紋。
2、HPLC/MS/MS-QTrap定量分析重度子癇前期組和正
16、常妊娠組血漿氨基酸代謝組,結果顯示兩組血漿氨基酸代謝組中苯丙氨酸、纈氨酸、精氨酸、鳥氨酸、脯氨酸差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.004、0.030、0.035、0.010、0.028)。
[結論]
建立的基于HPLC/MS/MS-QTrap代謝組學方法可以得到血漿氨基酸代謝輪廓譜,表明該方法適用于研究重度子癇前期的氨基酸代謝指紋。找到相對應的5種氨基酸在重度子癇前期和正常妊娠婦女血漿代謝有差異,為生物標記物群
17、預測重度子癇前期的發(fā)生提供線索。
全文小結:
1、建立的基于HPLC/MS/MS-QTrap代謝組學方法可以區(qū)分重度子癇前期和正常妊娠,表明該方法適合于重度子癇前期的代謝組學研究。
2、找到相對應的生物標記物群,對其進行增強型全掃描(EMS)及增強性子離子掃描(EPI),提供了大量代謝物結構上的信息,將來可以進一步鑒定代謝物名稱并對其深入研究。
3、代謝標記物群在重度子癇前期血漿濃
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