芳香化酶在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　雌激素（estrogen，E2）是乳腺癌的主要致癌原，通過(guò)與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結(jié)合而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。在絕經(jīng)后的乳腺癌患者中，雌激素的主要來(lái)源是外周組織中的雄激素通過(guò)芳香化酶（aromatase，Arom）的催化作用轉(zhuǎn)化為雌激素，芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitors, AIs）可阻斷這一反應(yīng)，從而阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),是絕經(jīng)后激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者輔

2、助內(nèi)分泌治療的一線方案。
　　然而，AIs的耐藥成為臨床應(yīng)用中的最大問(wèn)題，過(guò)去的研究主要集中在ER，ER信號(hào)通路與生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路之間的串話機(jī)制研究，目前AIs的耐藥機(jī)制仍不明確。芳香化酶（aromatase, Arom）是利用睪酮合成雌激素的限速酶，廣泛存在于人體，在女性胎盤(pán)，脂肪組織及腦（包括下丘腦，海馬，杏仁核等）中含量較高。雄激素經(jīng)芳香化酶、NADPH等輔基的氧化還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為雌激素的同時(shí)還可產(chǎn)生活性氧（reactiv

3、e oxygen species, ROS）。在正常的生理情況下，機(jī)體多種抗氧化酶SOD、GPx、GST、CAT等不斷清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS及自由基。ROS在不斷產(chǎn)生及清除中保持氧化還原系統(tǒng)穩(wěn)定，并在人體整個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。ROS在腫瘤中也有重要作用，是參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的第二信使。已有研究表明ROS、E2可以激活c-src激酶及下游信號(hào)通路，Arom可以被c-src激酶磷酸化，磷酸化位點(diǎn)是第361位的酪氨酸（pY361Arom

4、）。我們的前期研究表明Y361-Arom可以與PI3K調(diào)節(jié)亞基p-85結(jié)合，激活PI3K信號(hào)通路，而c-src激酶的抑制劑AZD0530（PP2）可以阻斷這種結(jié)合，逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)AIs的耐藥。因此我們推測(cè)：1、Arom在乳腺癌中維持體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，對(duì)乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展具有重要影響。2、c-src可被ROS、AD激活，繼而引起芳香化酶的磷酸化，激活下游PI3K信號(hào)通路，可能是導(dǎo)致AIs發(fā)生耐藥的主要原因之一，pY36

5、1Arom可能是預(yù)測(cè)乳腺癌對(duì)AIs敏感性的一個(gè)標(biāo)志物。本研究制備了特異識(shí)別Y361磷酸化芳香化酶的抗體，將對(duì)Arom及pY361Arom在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及AIs耐藥的機(jī)制進(jìn)行探索性研究。
　　方法：
　　第一部分 pY361Arom抗體制備及在乳腺癌中的臨床意義
　　1.公司合成多肽片段，通過(guò)動(dòng)物免疫的方法制備了pY361Arom多克隆抗體，用ELISA、免疫印跡、免疫組化等方法鑒定其敏感性和特異性；
　

6、　2.收集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院用AIs內(nèi)分泌治療的絕經(jīng)后乳腺癌患者60名，通過(guò)回顧性分析其臨床資料，歸納總結(jié)臨床病理資料，采用免疫組化的方法檢測(cè)乳腺癌組織中pY361Arom的表達(dá)情況，并用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用卡方檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)來(lái)分析 pY361表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系；采用 Kaplan-Meier生存分析方法進(jìn)行總生存分析，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)法。P≤0.05為差異具

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第二部分 Arom在ER陰性的乳腺癌細(xì)胞株中的作用
　　1.建立穩(wěn)定敲減Arom的SKBR3-shArom細(xì)胞系，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)，克隆形成實(shí)驗(yàn)，遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)，用免疫印跡法檢測(cè)Arom對(duì)pAKT(S473), p-85等蛋白的影響來(lái)探討Arom對(duì)ER陰性的乳腺癌細(xì)胞的作用；
　　2.c-Src抑制劑（PP2）處理BT549, SKBR3, MDA-MB-231細(xì)胞后，用免疫印跡的方法探討

8、PP2對(duì)pAKT(S473), pSrc(Y416), pY361Arom, p-85等蛋白的影響。
　　第三部分 Arom在ER陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株中的作用
　　1.采用高表達(dá) ER的BT549-ER細(xì)胞株，在無(wú)外源性雌激素培養(yǎng)的狀態(tài)下用分別用雌二醇（Estradoil, E2）和雄烯二酮（androstendine, AD）, Letrozole, PP2處理細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖情況，用免疫印跡法探討其對(duì)Src(Y416),

9、 pAKT(S473), p-85, pY361Aro蛋白的影響；
　　2.雄烯二酮（androstendine, AD）, Letrozole, PP2處理細(xì)胞，用免疫印跡探討其對(duì)pSrc(Y416), pAKT(S473), p-85, pY361Arom等蛋白的影響；
　　3.BT549-ER, SKBR3細(xì)胞株，在無(wú)外源性雌激素培養(yǎng)的狀態(tài)下，用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞活性自由氧（reactive oxgene spe

10、cies, ROS）水平的方法探討AD，Letrozole對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.制備了pY361Arom多克隆抗體，效價(jià)約1:1萬(wàn)，該抗體可用于ELISA, WB, IHC, IF。WB可特異性的檢測(cè)到蛋白pY361Arom，大小約55KD，最佳濃度1:1000，IHC最佳濃度1:2500，IF最佳濃度1:400,均為4℃過(guò)夜；
　　2.pY361Arom主要定位在乳腺癌細(xì)胞漿

11、內(nèi)，Kaplan-Meier生存分析顯示pY361Arom高表達(dá)與患者總生存期顯著相關(guān)，p≤0.05。但pY361Arom的表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、分期、ER、PR、Her2表達(dá)無(wú)相關(guān)性。
　　第二部分
　　1.敲減Arom后SKBR3細(xì)胞增殖減弱，與對(duì)照組相比p=0.042，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，遷移能力從95％±4.5%下降到36%±4.6%，侵襲能力從94%±4.3%下降到42%±4.2%和克隆形成能力從60%±4.5%

12、下降到38%±4.3%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，p≤0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，敲減Arom后, pAKT（S473）蛋白表達(dá)降低，p-85蛋白表達(dá)不變；
　　2.PP2處理BT549，MDA-MB-231, SKBR3細(xì)胞后pSrc(Y416)，pY361Arom，pAKT（S473）蛋白表達(dá)降低；
　　3.SKBR3細(xì)胞免疫熒光Arom與p-85，pY361Arom與p-85在細(xì)胞漿共定位。
　　第三部分
　　1.AD，E2

13、促進(jìn)BT549-ER細(xì)胞增殖能力，AD最佳濃度為100nM，與對(duì)照組相比p=0.04，E2最佳濃度為1nM,與對(duì)照組相比p=0.03，PP2，Letrozole處理BT549-ER細(xì)胞后,細(xì)胞增殖能力降低，與對(duì)照組相比p≤0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　2. AD濃度100nM處理BT549-ER后細(xì)胞后，pSrc(Y416)，pY361Arom，pAKT（S473）蛋白表達(dá)明顯升高。PP210μM，Letrozole100nM處理

14、BT549-ER細(xì)胞后免疫印跡pSrc（Y416），pY361Arom，pAKT（S473）蛋白表達(dá)降低；
　　3.DCFH-DA法檢測(cè)BT549細(xì)胞過(guò)表達(dá)ER前后加用100nM濃度AD處理2小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯上升分別上升約45%±4.2%和47%±3.6%，p≤0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Let處理2小時(shí)后兩株細(xì)胞內(nèi)ROS水平均無(wú)明顯變化。SKBR3經(jīng)AD處理后ROS水平升高約48%±3.2%，與未作任何處理的對(duì)照組相比具

15、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p≤0.05，而經(jīng)Let處理后ROS水平無(wú)明顯變化；在敲減了Arom的細(xì)胞SKBR3-shArom中，經(jīng)AD和Let處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.制備了pY361Arom兔多克隆抗體。
　　2.Arom敲減后可抑制SKBR3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、克隆形成，可能機(jī)制是下調(diào)pAKT（S473），同時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)定有重要調(diào)控作用，影響著乳腺細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展。
　　3.Sr

16、c抑制劑PP2對(duì)BT549，MDA-MB-231細(xì)胞敏感，而對(duì)SKBR3細(xì)胞不敏感。
　　4.AD, E2可刺激BT549-ER細(xì)胞的增殖，PP2，Letrozole可抑制其細(xì)胞的增殖。
　　5.pY361Arom可能是一個(gè)預(yù)測(cè)AIs耐藥的分子標(biāo)志，其機(jī)制可能是AD通過(guò)芳香化酶及NADPH的氧化還原反應(yīng)生成E2同時(shí)產(chǎn)生ROS，ROS及AD本身激活Src，引起pY361Arom活化，激活PI3K/AKT/mTOR，引起腫瘤細(xì)胞