人黑色素瘤相關抗原MAGE-B18與核因子kB調(diào)控蛋白TNIP1相互作用的研究.pdf

1、人黑色素瘤相關抗原MAGEB18與核因子KB調(diào)控蛋白TNIPl相互作用的研究中文摘要目的：旨在探討人黑色素瘤相關抗原MAGEB18與核因子KB調(diào)控蛋白TNIPl間的相互作用，同時確定其相互作用的結(jié)合位點，從而了解其相互結(jié)合的具體分子機制。在明確其分子作用機制后，采用多種手段證實其下游信號轉(zhuǎn)導機制。為該抗原的功能研究奠定基礎。方法：將人核因子KB調(diào)控蛋白TNIPl及人黑色素瘤相關抗原MAGEB18共轉(zhuǎn)染293T細胞，使用免疫共沉淀鑒定hM

2、AGEB18與TNIPl在293T細胞中是否存在相互作用。確定其能夠相互結(jié)合后，使用PCR方法構(gòu)建這兩種蛋白缺失不同結(jié)構(gòu)域的突變體攜帶HA及Myc標簽的真核表達載體并使其在293T細胞中表達后；再次使用免疫共沉淀確定其具體的結(jié)合位點。了解其相互結(jié)合的集體分子機制后，使用WesternBlotting等手段觀察其下游信號分子的活化情況。并使用流式細胞術觀測293T細胞活化后細胞凋亡率的變化。結(jié)果：免疫共沉淀結(jié)果表明TNIPl與MAGEB1

3、8蛋白在細胞內(nèi)能夠相互結(jié)合。成功構(gòu)建了人核因子KB調(diào)控蛋白TNIPl及人黑色素瘤相關抗原MAGEB18攜帶有標簽蛋白的突變體，并且成功地在293T細胞中進行了表達。并且鑒定出了TNIPl以及MAGEB18的相互結(jié)合位點分別位于311535aa與114284aa，使用半定量WesternBlotting驗證了TNIPl與MAGE—B18可以發(fā)生協(xié)同作用，從而影響核因子KB的活化。同時使用流式細胞術證實了TNIPl與MAGEB18發(fā)生協(xié)同作

4、用后可以抑制細胞凋亡。結(jié)論：黑色素瘤相關抗原MAGEB18可以與人核因子KB調(diào)控蛋白TNIPl在細胞內(nèi)發(fā)生相互作用。同時這兩種蛋白可以發(fā)生協(xié)同效應，從而抑制核因子KB活化。同時，在這兩種蛋白的共同作用下可以顯著抑制由于NFrB活化所產(chǎn)生的細胞凋亡。這為我們進一步研究MAGEB18以及TNIPl在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎。。關鍵詞：腫瘤；黑色素瘤相關抗原；MAGEB18；TNIPI；NFxB目錄弓l言1第l章實驗材料與方法411材

5、料4111主要儀器設備”4112質(zhì)粒、菌株與細胞株4113主要實驗試劑512方法”5121MAGEB18與TNIPl相互作用的研究5122表達MAGEB18與TNIPl突變體的真核表達載體的構(gòu)建及表達10123TNIPl與MAGEBl8作用位點的鑒定124MAGEBl81與TNIPl作用位點的鑒定192013MAGEB18與TNIPl對核因子KB(NFKB)調(diào)控的研究20131MAGEB18與TNIPl對核因子KB(NF—KB)下游轉(zhuǎn)錄