匯利心康及白藜蘆醇對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓及右心室重構(gòu)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、肺動脈高壓是進(jìn)行性和致命性疾病，系多種原因引起的肺循環(huán)壓力高于正常的病癥，可繼發(fā)右心室重構(gòu)、右心衰竭，故防治肺動脈高壓及右心室重構(gòu)具有重要的臨床意義?，F(xiàn)可用的降肺動脈高壓藥物不僅數(shù)量少、療效有限、且因缺乏針對性，因而存在諸多不良反應(yīng)。目前對右心室重構(gòu)的研究相當(dāng)有限，且臨床無針對性抗右心室重構(gòu)藥物，因此，尋找抗肺動脈高壓和/或抗右心室重構(gòu)新藥十分必要。肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)異常增殖，導(dǎo)致遠(yuǎn)端肺動脈腔狹窄，甚至阻塞，造成肺血管阻力

2、增加，是肺動脈高壓病理生理機(jī)制的重要特點。因此，抑制或逆轉(zhuǎn)肺動脈平滑肌增殖，改善遠(yuǎn)端肺動脈重構(gòu)，是預(yù)防和治療肺動脈高壓的關(guān)鍵措施之一。右心室重構(gòu)最初是繼發(fā)于內(nèi)在刺激和外部刺激的代償現(xiàn)象，最終會發(fā)展成為右心衰竭，是肺動脈高壓患者死亡的重要原因。因此，抑制右心室重構(gòu)發(fā)展具有重要意義。心肌細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞死亡的方式之一，與細(xì)胞壞死一道，共同調(diào)控心肌細(xì)胞數(shù)量，是各種病因?qū)е滦氖抑貥?gòu)的重要環(huán)節(jié)。 匯利心康(GCIP-27)是我室針對心肌肥

3、大發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用的Gaq羧基末端，克隆制備的一種G蛋白競爭性抑制性肽。既往研究證實：GCIP-27能有效抑制Angll，NA誘導(dǎo)的離體心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)，抑制不同動物模型的左心室重構(gòu)，并且GCIP-27抑制自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左心室重構(gòu)幾乎不依賴于其降低體循環(huán)動脈壓作用。另外，GCIP-27還可抑制SHR主動脈平滑肌重構(gòu)效應(yīng)以及抑制Angll所誘導(dǎo)體外血管平滑肌細(xì)胞增殖效應(yīng)。為此，本課題擬對GCIP-27防治MCT所誘

4、導(dǎo)的肺動脈高壓及右心室重構(gòu)作用及機(jī)制進(jìn)行了探索性研究。 白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然多酚類化合物，對心血管有多種益處。Res能抑制Ang-II，PE所誘導(dǎo)的離體心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)及抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖和分化，抑制不同模型的左心室重構(gòu)；另外，還具有保護(hù)肺血管內(nèi)皮及抑制Ang-II等引起的體外的大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞增殖作用；Res苷具有抑制急、慢性低氧型肺動脈高壓作用。鑒于目前尚缺乏針對性防治肺動脈高壓和右心

5、室重構(gòu)藥物，為了拓寬篩選領(lǐng)域，本課題一并研究Res對MCT所誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓及右心室重構(gòu)的防治影響。 方法： ♂SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(control組，n=8)、MCT模型組(MCT組，n=12)、GCIP-27低劑量預(yù)防處理組(GCIP-27-P-L組，n=8)、GCIP-27高劑量預(yù)防處理組(GCIP-27-P-H，n=8)、GCIP-27治療處理組(GCIP-27-T-H，n=8)、Res低劑量預(yù)防處理組

6、(Res-P-L組，n=8)，Res高劑量預(yù)防處理組(Res-P-H組，n=8)，Res治療處理組(Res-T-H組，n=8)。大鼠頸背部一次性皮下注射MCT(50 mg/kg)造模，于造模后1-21d或14-21d分別給GCIP-27(30，90μg/kg，ip，bid)或Res(10，30 mg/kg，ig，bid)處理。在實驗過程中，觀察動物一般狀況及動物死亡情況；在實驗第21d，用彩色多普勒超聲成像技術(shù)( CDFA)和肺脈沖多普

7、勒技術(shù)(PW)觀察所有存活動物的肺動脈加速時間(PAAT)、右心室游離壁厚度(RVFWT)、和三尖瓣返流等指標(biāo)的變化；在實驗第22d用右心導(dǎo)管術(shù)檢測肺動脈收縮壓(PASP)、肺動脈舒張壓(PADP)、平均肺動脈壓(MPAP)、右心室收縮壓( RVSP)等指標(biāo)；用稱重法測量和計算右心室肥大指數(shù)[RVHI=RV/(LV+SEP)]、右心室質(zhì)量指數(shù)(RVMI=RV/BW)、肺重指數(shù)(LI=LUNG/BW)；用石蠟包埋處理肺或右心室標(biāo)本；用偏振

8、光顯微鏡觀察右心室及肺HE染色形態(tài)學(xué)改變及免疫組化技術(shù)處理的相關(guān)抗原表達(dá)等變化：用透射電鏡技術(shù)(TEM)觀察右心室超微結(jié)構(gòu)；用TdT介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TNNEL)檢測右心室心肌細(xì)胞凋亡的變化，用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察肺動脈α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA抗原)，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，第八因子抗原表達(dá)的變化，以及右心室Bcl-2抗原和Bax抗原表達(dá)的變化。另外，針對造模后第14d-21d給予GCIP-27或Res處置的動物、正常對照

9、組動物和單純MCT模型組動物，我們用CDFA和PW技術(shù)觀察了這些動物在造模前、造模第14d、造模第21d的PAAT、RVFWT等指標(biāo)的動態(tài)變化。 結(jié)果： 1.MCT模型組有33％動物死亡，盡管這組動物開始時數(shù)目為12只，但在實驗期間分別于13d、14d、19d和20d各死亡1只動物，故該組僅剩8只存活動物進(jìn)入超聲及血流動力學(xué)檢測。其余存活MCT模型組大鼠一般狀況差，體重降低明顯；而GCIP-27或Res處理組無一只動物死

10、亡，一般狀況較好，并且顯著改善MCT所引起的體重下降。 2.與造模前相比，MCT顯著縮短大鼠的第14 d和21 d的PAAT(P<0.01)；與MCT組第21d相比，GCIP-27或Res明顯改善MCT所誘導(dǎo)的PAAT的縮短(P<0.05或P<0.01)；在造模第14-21d，給予GCIP-27或Res處置的MCT造模的大鼠，其第21天PAAT值比第14天的PAAT值延長(P<0.05)。 3.與正常對照組相比，MCT明

11、顯升高PASP、PADP、MPAP、RVSP(P<0.01)；與MCT組相比，GCIP-27顯著抑制MCT所誘導(dǎo)的PASP、RVSP的升高(P<0.05，P<0.01)，但僅GCIP-27-P-H處理組顯著抑制MCT所誘導(dǎo)的MPAP的升高(P<0.05)；與MCT組相比，除了對PADP沒有顯著水平的降低外(P>0.05)，Res明顯改善上述所有指標(biāo)的變化( P<0.05，P<0.01)。 4.偏振光學(xué)顯微鏡觀察左.肺.組織HE染

12、色的病理結(jié)構(gòu)揭示：MCT引起明顯的肺間質(zhì)炎癥，與正常對照相比，顯著增加LI、肺小動脈中膜相對厚度(p/0.01)，上調(diào)肺動脈α-SMA抗原的表達(dá)(P<0.01)，增加PCNA抗原核陽性的PASMCs數(shù)目(P<0.01)；與MCT組相比，GCIP-27和Res均一定程度減輕肺間質(zhì)炎癥，并且二者均不同程度顯著地改善上述指標(biāo)的變化(P<0.05，P<0.01)。 5.MCT明顯減少肺小動脈第八因子抗原的表達(dá)，減少肺毛細(xì)血管數(shù)量(P<0

13、.01)；與MCT組相比，Res不同程度地增加肺動脈第八因子抗原的表達(dá)，增加肺毛細(xì)血管數(shù)量( P<0.05，P<0.01)。 6.與造模前相比，MCT顯著升高大鼠第14 d和21d的RVFWT(P<0.01)，在造模21d，MCT組出現(xiàn)75％三尖瓣返流；與MCT組相比，GCIP-27或Res明顯改善MCT所誘導(dǎo)的RVFWT的增加(P<0.05，P<0.01)，并且GCIP-27或Res處理的動物均無三尖瓣返流；在造模第14-21

14、d，給予GCIP-27或Res處置的MCT造模的大鼠，其第21天RVFWT值比第14天的RVFWT值明顯減少(P<0.01)。 7.與正常對照組相比，MCT明顯升高RVHI、RVMI(P<0.01)；與MCT組相比，GCIP-27顯著抑制MCT所誘導(dǎo)的RVHI和RVMI的增高(p<0.01)；與MCT組相比，Res也顯著抑制MCT所誘導(dǎo)的RVHI，RVMI的增高(P<0.05，P<0.01)。 8.偏振光學(xué)顯微鏡觀察右心

15、室組織HE染色的病理結(jié)構(gòu)揭示：MCT組心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞橫截面積和細(xì)胞長度均顯著增加，胞漿腫脹，心肌細(xì)胞間質(zhì)增生等。與MCT組相比，GCIP-27及Res均不同程度地明顯抑制MCT所引起的右心室組織病理結(jié)構(gòu)改變。 9.TEM觀察右心室心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示：右心室心肌細(xì)胞線粒體腫脹、內(nèi)有空泡形成、呈髓鞘樣退行性改變、肌漿網(wǎng)擴(kuò)張、橫紋、Z線不清、肌絲排列紊亂及部分肌絲局灶性壞死：與MCT組相比，GCIP-27及Res均不同程

16、度地明顯改善MCT所引起的右心室心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 10. MCT明顯增加右心室心肌細(xì)胞TUNEL陽性心肌細(xì)胞的數(shù)量(P<0.01)，下調(diào)右心室心肌細(xì)胞的Bcl-2抗原的表達(dá)(P<0.01)和上調(diào)心肌細(xì)胞的Bax抗原的表達(dá)(P<0.01)；與MCT組相比，GCIP-27顯著改善MCT所引起上述指標(biāo)的變化(P<0.01)；Res也改善MCT所引起上述改變(P<0.05，P<0.01)。 結(jié)論： 1.GCIP-

17、27特異性抑制MCT誘導(dǎo)的右心室重構(gòu)效應(yīng)，與抗心肌細(xì)胞凋亡及一定程度地降低肺動脈高壓作用相關(guān)。 2.GCIP-27通過上調(diào)心肌細(xì)胞Bcl-2抗原、下調(diào)Bax抗原的表達(dá)、保護(hù)心肌細(xì)胞的線粒體及一定程度降低右心室后負(fù)荷而抑制右心室心肌細(xì)胞凋亡。 3.GCIP-27抑制PASMCs增殖、改善肺動脈重構(gòu)，一定程度地抑制MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓。 4.Res抑制MCT誘導(dǎo)的右心室重構(gòu)，與抗心肌細(xì)胞凋亡及降低肺動脈高壓作用相關(guān)