細腳擬青霉多糖的結(jié)構(gòu)與活性研究.pdf

1、目的 1．研究細腳擬青霉多糖的結(jié)構(gòu)特征； 2．探討細腳擬青霉多糖的免疫活性及其構(gòu)效關(guān)系。 方法 1．采用用水提、乙醇沉淀及Sevag法除蛋白分離提取細腳擬青霉總多糖(tPTPS)。以DEAE-纖維素-52離子交換柱對細腳擬青霉總多糖進行分組，收集主要組分(PTPS)。 2．以CellCountingKit8(CCK-8)分析PTPS對小鼠脾細胞增殖活性的影響；以酶法和RT-PCR方法檢測PTPS對

2、小鼠腹腔巨噬細胞(PM(I))一氧化氮(NO)的產(chǎn)生和iNOSmRNA表達的影響。 3．用SephadexG100凝膠柱對PTPS進一步純化，收集純化組分PTPS-I。采用紫外掃描、高效液相色譜法(HPLC)進行純度和分子量測定。 4．采用氣相色譜法(GC)分析PTPS-I單糖組成，高碘酸氧化、部分酸水解、紅外光譜(IR)以及核磁共振(NMR)分析PTPS-I的結(jié)構(gòu)特征。 5．體外培養(yǎng)人外周血單個核細胞(MNC)

3、72h，以CCK-8試劑比較分析PTPS-I在部分酸水解前后對MNC增殖活性的影響；PTPS-I直接與腫瘤紅白血病細胞株K562，喉癌細胞Hep2和肝癌細胞SMMC-7721共培養(yǎng)24h，用CCK-8檢測PTPS-I的細胞毒作用；收集PTPS-I與MNC培養(yǎng)48h的上清(PTPS-I-MNC)，與K562細胞，Hep2細胞和SMMC-7721細胞共培養(yǎng)72h后，用CCK-8檢測腫瘤細胞的增殖活性；以不同濃度的PTPS-I誘導(dǎo)MNC6h后

4、，用Trizol提取總RNA，實時熒光定量PCR檢測細胞因子TNF-amRNA和IL-6mRNA的表達。 結(jié)果 1．細腳擬青霉總多糖(tPTPS)為褐色粉末狀固體，經(jīng)DEAE-纖維素一52離子交換柱層析分組，收集第l峰的組分PTPS，冷凍干燥后為白色粉末狀固體。 2．PTPS能促進體外培養(yǎng)的小鼠脾細胞增殖，增強小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO和iNOSmRNA的表達。 3．PTPS-I純度為98．977％，不含蛋

5、白和核酸。分子量為1．84x104D，由甘露糖和半乳糖(13：1)組成，含有α-和β-構(gòu)型的糖苷鍵，主鏈主要由α-(1→6)-Man、a-(1→2)-Man、p一(1→3)-Man和α一(1→6)-Gal及少量p一(1→6)-Gal組成；側(cè)鏈由α一(1→3)-Gal和6-(1→3)-Gfl組成；末端為p—D-Gal。 4．PTPS-I水解前后，在300mg／L和500mg／L濃度時均能促進MNC增殖，二者比較沒有顯著差異。

6、 5．當PTPS-I濃度達到500mg/L時，其對K562細胞，Hep2細胞和SMMC-772l細胞沒有直接的細胞毒作用。 6．PTPS-I在300mg/L和500mg~濃度時的PTPS-I-MNC能抑制腫瘤細胞Hep2和K562的增殖；在500mg/L濃度時的PTPS-I-MNC抑制腫瘤細胞SMMC-7721的增殖。 7．PTPS-I在一定濃度范圍內(nèi)時能顯著增強TNF-αmRNA(100mg/L～500mg/L)和I

7、L-6mRNA(30mg/L～500mg／L)的表達，并顯現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。 結(jié)論 1．PTPS能促進小鼠脾細胞增殖，增強小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO和iNOSmRNA的表達，提示PTPS具有免疫調(diào)節(jié)作用。 2．PTPS-I是由甘露糖和半乳糖組成的雜多糖分子，分子結(jié)構(gòu)為： (1)主鏈含a．(1→6)-Man、Q一(1→2)-Man、p一(1→3)一Man和α一(1→6)-Gal及少量p一(1→6)一Gal；v(