光信號在花生莢果發(fā)育初期的作用機理研究.pdf

1、花生是我國重要的油料作物，油脂和蛋白質(zhì)二者之和高達(dá)80％，是我國食用油和植物蛋白的主要來源。植物果實是多種農(nóng)作物的收獲器官，果實的正常生長和發(fā)育直接影響種子的產(chǎn)量和品質(zhì)?；ㄉv果發(fā)育過程與其它植物有很大不同?；ㄉ_花受精后，受精卵僅進(jìn)行少數(shù)幾次分裂形成原胚后便停止進(jìn)一步發(fā)育，而子房卻不斷伸長形成向地生長的“果針”。當(dāng)果針將位于其頂端的胚珠推入土壤后，果針停止伸長，而胚胎的發(fā)育在黑暗的條件下重新啟動，并最終膨大形成莢果。大量研究表明，光是

2、調(diào)控花生莢果發(fā)育的關(guān)鍵因素。由于紅光和遠(yuǎn)紅光能可逆地影響花生胚珠的生長，因此，推測感受紅光和遠(yuǎn)紅光信號的光敏色素是調(diào)控花生莢果發(fā)育的關(guān)鍵因子。光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在模式植物擬南芥中已經(jīng)有較為深入的研究，光敏色素被光激活進(jìn)入細(xì)胞核后，通過調(diào)控下游一系列基因的表達(dá)影響不同的生物學(xué)過程，如生長素的合成、運輸和響應(yīng)，赤霉素的合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等。然而，光如何調(diào)控花生莢果發(fā)育的分子機制還不清楚。本研究首先分析了花生從受精至果針入土膨大過程中不同發(fā)育時期

3、胚胎的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)果針入土前后、莢果膨大前后是花生莢果早期發(fā)育的關(guān)鍵時期，因此選取未入土果針(S1)、入土后未膨大果針(S2)和入土頂端膨大形成“雞頭”形的果針(S3)為材料，進(jìn)行高通量測序，分析了花生果針尖端胚胎著生部位(ER)和果針基部伸長區(qū)(BR)在這三個時期全基因組水平范圍內(nèi)基因的表達(dá)變化，并以花生栽培品種魯花14號(LH14)為材料克隆了光敏色素基因家族，并對其序列特征、表達(dá)模式、蛋白積累水平以及在擬南芥和花生中的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)

4、行了初步研究，同時還克隆了光敏色素互作因子PIF3，驗證了PIF3與花生光敏色素的相互作用，構(gòu)建PIF3的誘餌載體，進(jìn)行了酵母文庫互作蛋白質(zhì)的篩選。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)花生解剖學(xué)和形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果表明，花生從開花到受精4d后，受精卵經(jīng)過少數(shù)幾次分裂形成“棒狀”的原胚，同時果針不斷向上生長;隨后，“棒狀”原胚暫停發(fā)育，而果針不斷伸長并向地生長;果針入土3d時，原胚開始恢復(fù)發(fā)育，胚柄伸長，同時果針頂端由入土前的紫色或綠色變?yōu)?/p>

5、白色;果針入土9d時，果針基部的胚發(fā)育成球形胚，此時，果針頂端膨大呈“雞頭”形。從開花到果針入土前，受精卵經(jīng)歷了從單細(xì)胞到“棒狀”原胚的分裂過程，而在果針向地生長過程中，胚胎的發(fā)育處于相對靜止?fàn)顟B(tài);果針入土以后，胚胎在黑暗條件下重新啟動發(fā)育，這一過程伴隨莢果的膨大。
　　(2)數(shù)字基因表達(dá)譜結(jié)果表明，光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及植物激素如生長素、赤霉素、脫落酸、細(xì)胞分裂素和乙烯的合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因在果針入土前后和莢果膨大前后在E

6、R區(qū)和BR區(qū)的表達(dá)發(fā)生改變。例如，ER和BR區(qū)的LSD1蛋白、SPA1蛋白、向光素(phototropin)、早期光誘導(dǎo)的蛋白和rootphototropism蛋白的編碼基因在S2和S3時期的表達(dá)水平都低于S1時期的表達(dá)水平;ER和BR區(qū)的indole-3-acetic acid-amido synthetase基因在S2時期的表達(dá)水平均低于在S1時期的表達(dá)水平;ER區(qū)生長素誘導(dǎo)蛋白(auxin-induced protein)基因在S

7、2時期的表達(dá)水平低于S1時期的表達(dá)水平，而BR區(qū)該基因在S2時期的表達(dá)水平高于S1時期的表達(dá)水平;ER區(qū)的GA20氧化酶(gibberellin20 oxidase)基因在S3時期的表達(dá)水平比S1時期和S2時期高，赤霉素調(diào)節(jié)蛋白(gibberellin-regulated protein)基因和GA2氧化酶（gibberellin2-oxidase）基因在S3時期的表達(dá)水平比S1時期和S2時期低;BR區(qū)的赤霉素調(diào)節(jié)蛋白基因和GA20氧化

8、酶基因在S2時期和S3時期的表達(dá)水平低于S1時期，GA2氧化酶基因在S2時期和S3時期的表達(dá)水平高于S1時期。果針發(fā)育的不同時期，我們在ER區(qū)鑒定到一些與莢果膨大的相關(guān)基因，包括WRKY、MYB、bHLH和MADS轉(zhuǎn)錄因子家族，以及參與細(xì)胞壁合成和降解、調(diào)控胚胎發(fā)育的相關(guān)基因等。
　　(3)在兩個野生花生Arachis duranensis和Arachis ipa百nsis中各鑒定到4個光敏色素，包括phyA、phyA-like、

9、phyB和phyE。phyA、phyA-like和phyB在兩個野生種中分別位于對應(yīng)的染色體，且外顯子數(shù)目相同，而phyE位于非對應(yīng)的染色體且外顯子數(shù)目不同。野生花生光敏色素基因的長度從2574 bp到3390bp，氨基酸序列的長度從858aa到1130aa。
　　(4)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組和野生花生全基因組測序信息，利用RACE和同源克隆等技術(shù)在栽培花生LH14中克隆到AhphyA、AhphyA-like、AhphyB和AhphyE的全長

10、CDS序列，分別為3378bp、3378bp、3456 bp和3342 bp，編碼1125aa、1125aa、1151 aa和1113 aa?；ㄉ膫€光敏色素均包含N端的PAS結(jié)構(gòu)域、GAF結(jié)構(gòu)域、PHY結(jié)構(gòu)域和C端的PRD結(jié)構(gòu)域和HKRD結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，花生光敏色素與野生花生、大豆、百脈根、苜蓿和豌豆的光敏色素親緣關(guān)系較近，與擬南芥、油菜、煙草等光敏色素的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　(5) qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，四個花生光敏

11、色素基因在花生不同組織及花生果針不同發(fā)育時期的表達(dá)有差異。四個花生光敏色素基因在不同組織中均有表達(dá)，AhphyA、AhphyA-like和AhphyB在花中的表達(dá)量最高，而AhphyE在葉中表達(dá)量最高;AhphyA、AhphyA-like、AhphyB和AhphyE在果針三個發(fā)育時期的表達(dá)差異不大。
　　(6) Western Blot檢測AhphyA和AhphyB在花生下胚軸及果針中的蛋白積累結(jié)果表明，與擬南芥相同，AhphyA

12、在光照處理的下胚軸中降解，降解半衰期約為2h，而AhphyB在下胚軸中的積累對光照處理不敏感;在花生果針的三個不同發(fā)育時期中，均未檢測到AhphyA蛋白的積累，而在入士9d的果針中檢測到AhphyB的積累。結(jié)果表明，AhphyB蛋白可能在果針入土以后參與了花生莢果的發(fā)育過程。
　　(7) AhphyA和AhphyB基因在擬南芥中的功能驗證。構(gòu)建AhphyA基因和AhphyB基因的過量表達(dá)載體，通過花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)半定量PC

13、R和Western Blot驗證結(jié)果表明，AhphyA和AhphyB在擬南芥中正常表達(dá)。
　　(8)遠(yuǎn)紅光(FR)處理下，異源表達(dá)AhphyA基因的擬南芥下胚軸伸長受抑制的程度強于對照，可能是由于AhphyA基因過量表達(dá)增強了下胚軸對FR的敏感性，從而抑制了下胚軸的伸長;
　　紅光(R)處理下，異源表達(dá)AhphyB基因的擬南芥下胚軸伸長受抑制的程度強于對照，其長度顯著低于野生型擬南芥的下胚軸長度，這說明在紅光條件下，Ahph

14、yB具有抑制下胚軸伸長的功能。
　　(9) AhphyA和AhphyB基因在花生中的轉(zhuǎn)化。將AhphyA和AhphyB基因構(gòu)建過量表達(dá)載體和干擾載體，通過花萼管注射法，將AhphyA和AhphyB基因的過量和干擾載體轉(zhuǎn)化花生，經(jīng)過PCR鑒定，已經(jīng)初步獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株。
　　(10)酵母雙雜交實驗結(jié)果表明，AhphyA、AhphyA-like和AhphyB的C端均能與AhPIF3互作，而AhphyA、AhphyA-like