Notch信號途徑在Breg發(fā)育及變態(tài)反應應答中的作用研究.pdf

1、免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)依賴于效應性細胞和調(diào)節(jié)性細胞的平衡。與效應T細胞相對應的調(diào)節(jié)性T細胞已經(jīng)得到證實,其存在及功能具有重要的意義。對于B細胞,一直認為其通過產(chǎn)生抗體、提供共刺激分子、提呈抗原在免疫反應中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用1,然而最近研究發(fā)現(xiàn),免疫系統(tǒng)中還存在發(fā)揮負向調(diào)節(jié)功能的B細胞亞群——調(diào)節(jié)性B細胞(regulatory B cell,Breg)。
　　Breg是近年來確認的一類具有負向免疫調(diào)節(jié)功能的B細胞亞群,在實驗性自身免疫性腦脊髓

2、炎(EAE)2、炎癥性腸炎3、系統(tǒng)性紅斑狼瘡4、接觸性過敏反應5、感染和腫瘤6等疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。部分Breg亞群的免疫調(diào)節(jié)功能依賴于IL-10,又被稱為B10細胞6,7。最近揭示了產(chǎn)生IL-10的Breg的表型,2008年Tedder等5研究發(fā)現(xiàn),在小鼠脾臟產(chǎn)生IL-10的B細胞大多數(shù)存在于CD5+CD1dhighCD19+B細胞亞群,這一亞群B細胞盡管只占野生型小鼠脾臟B細胞的很小一部分,但卻是產(chǎn)生IL-10的主要細胞1。C

3、D5+CD1dhighCD19+B10細胞的鑒定是Breg研究領域的一項重要進展,為進一步研究其起源、發(fā)育和功能特點奠定了基礎。
　　Breg的發(fā)育和功能受多種信號途徑的調(diào)控,TLR信號、BCR信號、CD40信號均參與了Breg發(fā)育的調(diào)控,IL-21也是調(diào)控Breg細胞功能的重要分子。然而,但到目前為止,Breg發(fā)育的確切調(diào)控機制尚未完全闡明。
　　Notch信號途徑是調(diào)控細胞雙向亞群發(fā)育和雙向功能分化的重要信號途徑,不僅參

4、與T/B細胞分化、CD4/CD8T細胞分化等調(diào)控,還參與巨噬細胞的M1/M2極化、樹突狀細胞的致應答/致耐受的調(diào)控等,但Notch信號途徑在Breg細胞發(fā)育及B細胞的正向/負向免疫調(diào)節(jié)功能中的作用及機制尚不明確。Notch信號通路包括Notch配體、Notch受體以及下游信號轉(zhuǎn)導分子和調(diào)節(jié)分子,Notch受體的激活需要轉(zhuǎn)錄因子RBP-J來介導,將其敲除可以阻斷所有Notch受體的信號,從而得到Notch受體完全失活的模型。我們課題組前期

5、研究發(fā)現(xiàn)RBP-J基因敲除小鼠的邊緣帶前體(T2-MZP)B細胞的數(shù)目減少,邊緣帶B(MZB)細胞數(shù)量也減少。結合最新研究認為Breg細胞來源于T2-MZP細胞,我們推測Notch信號途徑在Bregs的發(fā)育和功能中可能也發(fā)揮著關鍵性的作用。
　　目的:本研究擬利用在B細胞特異性剔除Notch信號分子RBP-J基因的小鼠,分析Notch信號對Breg細胞發(fā)育影響,同時分析Notch信號途徑在B細胞特異性缺失后對接觸性超敏反應和口服免

6、疫耐受應答的影響。
　　方法:將CD19-Cre小鼠與RBP-flox小鼠交配,獲得CD19-Cre-RBP-Jf/f基因型的小鼠,流式細胞儀分析該小鼠CD19+CD5+CD1dhighBreg的數(shù)量和比例;分離上述小鼠脾臟細胞,體外給予不同刺激,流式細胞儀檢測分泌IL-10的B10細胞數(shù)目及B10前體細胞數(shù)目,分析Notch對B10細胞發(fā)育的影響。利用CD19-Cre-RBP-Jf/f小鼠和對照小鼠制備接觸性超敏反應和口服免疫耐

7、受模型,分析Notch信號途徑在B細胞特異性缺失小鼠與對照小鼠相比在接觸性皮炎炎癥反應和特異性IgE應答等方面的差異。
　　結果:
　　(1)獲得了在B細胞特異性敲除RBP-J基因的小鼠;與雜合小鼠相比,CD19-Cre-RBP-Jf/f小鼠脾臟CD19+CD5+CD1dhighBreg數(shù)量顯著降低;小鼠脾細胞體外刺激,細胞表面和胞漿內(nèi)抗體染色后,進行流式細胞術檢測,結果顯示表達IL-10的B10及B10前體細胞的數(shù)目明顯少

8、于對照組。
　　(2)在接觸性超敏反應模型中,B細胞特異性敲除RBP-J基因的小鼠耳廓較雜合子小鼠厚度改變更為明顯,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色切片中顯示炎癥更顯著,即B細胞特異性敲除RBP-J基因的小鼠接觸性超敏反應更為嚴重。
　　(3)在口服免疫耐受模型中,CD19-Cre-RBP-Jf/f小鼠血清中IgE的水平較雜合子小鼠明顯升高,提示B細胞特異性敲除RBP-J基因的小鼠誘導產(chǎn)生免疫耐受